二硝基氯苯致大鼠变应性接触性皮炎模型的构建

何文凤张云璧∗王蓬文任 映张 乙陈怡瑾杨涵雯李瑷同

·论著·

二硝基氯苯致大鼠变应性接触性皮炎模型的构建

何文凤1张云璧1∗王蓬文2任 映2张 乙3陈怡瑾3杨涵雯3李瑷同3

目的: 构建二硝基氯苯外用致大鼠背部变应性接触性皮炎模型。方法: 利用二硝基氯苯作为致敏剂，对大鼠皮肤进行致敏和激发。激发后24 h取材，观察皮肤病理改变，利用ELISA法检测血清IL－4和TNF－α的表达。结果: 大鼠背部皮肤激发24 h后，肉眼可见不同程度的红斑、肿胀；组织病理示:表皮、真皮内大量炎症细胞浸润；ELISA结果显示TNF－α水平升高，IL－4水平降低。结论:成功构建二硝基氯苯诱导的大鼠背部ACD模型，弥补了小鼠ACD模型的不足。

大鼠； 二硝基氯苯； 变应性接触性皮炎

1 材料与方法

1.1 实验材料 动物为SPF级雌性，4～5周龄，SD大鼠14只，由北京维通利华实验动物技术有限公司供给[SCXK(京)2012－0001]，饲养和实验均在北京中医药大学东直门医院屏障环境动物室内进行[SYXK(京)2009－0028]。

丙酮溶液(北京化学试剂公司)，二硝基氯苯(上海哈灵科技有限公司)，薇婷脱毛膏(利洁时家化中国有限公司)，IL－4、TNF－α ELISA试剂盒(Ebioscience公司)，全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)。

1.2 方法 分组:实验动物适应性喂养1周后，随机分为2组，空白组与模型组，每组7只，两组均于实验前1天背部脱毛2处，甲处面积约2 cm×3 cm，乙处面积约4 cm×4 cm(图1)，空白组给予丙酮溶液涂抹，模型组则建立ACD模型。

大鼠ACD模型的建立:模型组脱毛后24 h于脱毛区甲处外涂7%的DNCB丙酮溶液致敏，2周后，于脱毛区乙处外涂0.1%的DNCB丙酮溶液激发。

取材激发后24 h实验动物于麻醉状态下采血于

EP管中，离心处理后分离血清，放入－20℃冰箱下保存待测；取1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm激发处皮肤固定于10%中性缓冲福尔马林液中待用。

1.3 评价指标 体征评分标准:大鼠激发后24 h观察激发部位皮肤反应，皮损的评分采用赵辨EASI评分法，2临床表现分为四项，即:红斑，硬肿(水肿)/丘疹，表皮剥脱，苔藓化。每一临床表现的严重度以0～3分计分，0分＝无，1分＝轻，2分＝中，3分＝重，各种症状分值之间可记半级分，即0.5分。打分原则:0分:无此体征出现；1分:此体征存在，但需仔细观察才能见到；2分:此体征可立即看到；3分:此体征非常明显。组织学观察4 μm石蜡切片，HE染色，观察组织病理变化。ELISA检测IL－4、TNF－α的表达。操作方法按照试剂盒说明书进行，在酶标仪450 nm波长检测各孔的吸光度值，并根据标准曲线得出相应IL－4、TNF－α的表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，实验数据用¯x±s表示，进行独立t检验。显著性检验水平为0.05。

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2 结果

2.1 肉眼观察结果 模型组大鼠背部甲处皮肤致敏后可见明显红斑、肿胀及丘疹(图2)。激发后24 h观察模型组大鼠背部乙处皮肤，激发后乙处皮肤可见明显弥漫性红斑、边界不清，略肿胀(图3)。其中红斑严重度轻者1只，占14.3%，中者1只，占14.3%，重者5只，占71.4%。水肿严重度轻者6只，占85.7%，中者1只，占14.3%。

2.2 镜下观察结果 组织病理学检查示:激发后24 h，模型组大鼠激发部位皮肤轻度角化过度，表皮、真皮内可见大量炎症细胞浸润(图4)。

图1 大鼠背部脱毛过程

图2 模型组致敏后背部皮肤(甲处)

图3 激发后背部皮肤(乙处)

图4 激发后皮肤病理变化

2.3 血清IL－4、TNF－α水平 模型组大鼠血清TNF－α的表达水平较空白组明显增高(P＜0.05)，而IL－4的表达水平较空白组明显降低(P＜0.05)(表1)。

表1 TNF－α、IL－4在大鼠血清中的表达

3 讨论

湿疹、变应性接触性皮炎等与IV型变态反应相关的疾病是皮肤科门诊常见的疾病之一。世界变态反应组织(WAO)在30个国家对过敏性疾病的流行病学调查结果，这些国家12亿总人口中，2.5亿人(22%)患有不同种类的过敏性疾病。3其中皮肤变态反应更为高发，20%的人口受其困扰，4全球仅抗变态反应药物这一项的支出已超过80亿美元。5

建立可靠的ACD动物模型，不但可用于该类疾病发病机制的研究，更是临床前研究药物疗效的保障。几十年来，人们最常选用小鼠耳廓建立ACD模型，该模型常用于筛选治疗该类疾病药物的药效学研究，但小鼠ACD模型的靶皮损多取耳廓，观察指标多为耳廓的肿胀度等，而不利于对皮损中红斑、水肿、表皮剥脱、苔藓化等的整体状况研究。本实验选择大鼠背部皮肤作为研究对象，用DNCB诱导变态反应性接触性皮炎，从红斑、水肿、表皮剥脱、苔藓化等多方面观察，更符合变态反应性皮肤炎症的皮损表现。ACD是典型的IV型迟发性变态反应。由CD4＋Th1细胞介导，Th1型细胞因子IFN－γ、IL－2、TNF－α起上调作用，Th2型细胞因子IL－4起下调作用。6Th1/Th2失衡引起细胞因子分泌异常在ACD的发生发展中起重要作用。Th1、Th2细胞产生的细胞因子之间存在互相拮抗的作用，IL－4能抑制IFN－γ的产生，下调Th1细胞分化；相反，IL－4促进Th2细胞分化。本研究观察到，DNCB诱导ACD大鼠模型血清中TNF－α明显升高，而IL－4降低，提示DNCB诱导ACD模型为Th1型免疫反应，这与国内外研究结果一致。7，8

本实验中，ACD模型组大鼠背部激发处皮肤表现以弥漫性红斑、肿胀为主，组织病理结果示有大量炎症细胞浸润，与典型的接触性皮炎病理相符，9说明本实验成功建立大鼠背部ACD模型。

本实验成功建立了大鼠背部的ACD模型，为背部皮炎模型代替耳廓皮炎模型提供了可行性，背部模型肿胀度高、易于肉眼判断，且大鼠背部面积大，可以分成多个区域进行试验及取材，不仅便于直接观察，更适于抗变态反应药物的药效研究。

在现有工作中，以大鼠为实验对象建立ACD模型的文章较少，故该次造模的工作重点在于找到合适的实验方法以成功建立大鼠ACD模型。包括选择合适的致敏剂浓度、掌握好致敏与激发的间隔时间等，因此在炎症相关因子的检测方面有所欠缺，对采用大鼠ACD模型进行变应性接触性皮炎药物疗效观察方面未能有更多指导。在后续试验中，我们将在成功建立大鼠ACD模型的基础上，进行各类炎症相关因子的检测以进一步证实大鼠ACD模型的实用性。

1王国江，顾军.小鼠背部变应性接触性皮炎模型的建立.中国职业医学，2004，31(1):17－19.

2赵辨.湿疹面积及严重度指数评分法.中华皮肤科杂志，2004，37(1):3－4.

3尹佳.2005年7月8日是首个世界过敏性疾病日.中华医学杂志，2005，85(25):1769－1769.

4 Laughter D，Istvan JA，Tofte SJ，et al.The prevalence of atopic dermatitis in oregon schoolchildren.J American Academy Dermatol，2000，43(4):649－655.

5刘瑞玲.过敏性疾病的诊断与治疗.中国临床医生，2003，1 (9):4－5.

6郭丽芳，范卫新，汤爱民.两种变应原致小鼠变应性接触性皮炎的研究.中华皮肤科杂志，2005，38(4):229－231.

7 Hopkins JE，Naisbitt DJ，Kitteringham NR，et al.Selective haptenation of cellular or extracellular protein by chemical aller-

gens:association with cytokine polarization.Chemical Research in Toxicology，2005，18(2):375－381.

8李敏，关洪全.疏风饮对变应性接触性皮炎小鼠脾指数、胸腺指数及 IFN－γ与 IL－4分泌的影响.实用中医内科杂志，2011，25(1):24－25.

9陈锡唐，刘季和，丘丙森，等.实用皮肤组织病理学.广州:广东科技出版社，1994.163－167.

(收稿:2014－09－08 修回:2014－10－21)

图1 头面、颈、前胸、腹部弥漫充血水肿性红斑，其上可见松弛性大疱、脓疱，大片糜烂、渗出。口周、眼睑周围渗出、结痂，口周呈放射状皲裂 图2 背部弥漫充血水肿性红斑，其上可见松弛性大疱、脓疱，大片糜烂、渗出

诊断:金黄色葡萄球菌烫伤样皮肤综合征。

治疗:给予I级护理，流质饮食；头孢曲松钠0.70 g/日分2次(患儿13 kg)静滴抗感染，5%葡萄糖注射液、维生素C静滴营养支持。躯干、四肢、外阴以1%乳酸依沙吖啶溶液湿敷，干燥结痂处外涂莫匹罗星软膏，眼部以金霉素软膏每日专项护理，口腔以碳酸氢钠溶液每日专项护理。经上述综合治疗，患者病情逐渐好转，7天后基本痊愈，好转出院。

讨论 金黄色葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征(简称SSSS)是由凝固酶阳性、第2噬菌体组金黄色葡萄球菌感染并分泌表皮剥脱毒素引起的一种以全身性红斑、松弛性大疱及大片表皮剥脱为特征的水疱性急性严重性皮肤病，具有接触传染性，主要累及新生儿和幼儿，个别病例可出现危重症，病死率高达3%～4%。2与预防接种有关的SSSS极为罕见，既往文献中，仅报道过1例与接种流感疫苗相关的小儿SSSS，3但未见因接种流脑疫苗引起该病的报道。本例患儿接种流脑疫苗2天后，躯干即出现红斑、水疱、脓疱，迅速波及全身，继发糜烂、渗出，口周、眼睑周围渗出、结痂，口周呈放射状皲裂。实验室检查:白细胞升高，疱液培养检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，符合SSSS表现，诊断成立。追问病史，患儿在发病前1个月内，除接种过流脑疫苗外，未接种过其他疫苗，无其他药物应用史。综合既往用药史、临床症状及体征、实验室检查结果，认为:该患儿发生SSSS与接种流脑疫苗关系较大。其原因可能与接种操作流程不规范、消毒措施不当至直接细菌感染或交叉感染有关。同时，也不排除该患儿接种流脑疫苗后所启动的免疫应答导致免疫功能紊乱，从而增加了发生SSSS的机会。

本例为1例疑似因接种流脑疫苗引起SSSS的个案，应当引起有关部门的重视，加强安全接种，严格遵守操作规程，避免接种反应的发生。

参考文献

1杨声坪，李婧媛.国内流脑疫苗预防接种不良反应评价.中国循证医学杂志，2011，11(12):1468－1470.

2樊翌明，吴志华.葡萄球菌烫伤样皮肤综合征的研究进展.国外医学皮肤性病学分册，2002，28(1):22－24.

3苗吉刚，庞强.1例因接种流感疫苗引起的金黄色葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征报告.预防医学论坛，2009，15(11):1164.

(收稿:2013－12－21 修回:2014－01－21)

Construction of rats model for allergic contact dermatitis induced by DNCB

HE Wen-feng，ZHANG Yun-bi，WANG Peng-wen，et al.Department of Dermatology，Dongzhimen Hosipital，BUCM，Beijing，100700

Objective:To construct a rat model for allergic contact dermatitis(ACD)induced by DNCB. Methods:The dorsal skin in rats was sensitized and challenged with DNCB.The histopathologic examination of lesions was done 24 hours after challenge and the levels of TNF－α and IL－4 in serum were detected with ELISA.Results:Different degrees of erythema and edema were observed in lesions after 24 hours challenge. Biopsy showed inflammatory cells infiltration.ELISA showed the level of TNF－α was increased and the level of IL－4 was decreased.Conclusion:The model of rat model for ACD was constructed successfully，which made up for the lack of mice model for ACD.

rats；dinitrochlorobenzene；allergic contact dermatitis

1北京中医药大学东直门医院皮肤科，北京，100700 2北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室和北京市重点实验室，100700 3北京中医药大学，北京，100029

∗通信作者