一株高效防治甜菜夜蛾的莱氏野村菌的筛选

钟万芳，李雪萍，郭慧芳*

(1.江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014;2.云南大学医学院，昆明 650091)

甜菜夜蛾 Spodoptera exigua 属鳞翅目Lepidoptera 夜蛾科Nocruidae，是世界性分布、间歇性大发生的、以危害蔬菜为主的杂食性害虫。甜菜夜蛾寄主范围很广，主要危害茄子、黄瓜、豇豆、花椰菜等35 科108 属170 余种植物。由于该虫对化学农药抗药性的不断增强，近年来在我国南方发生有加重趋势(文礼章等，2014)。真菌是唯一能在自然条件下通过体壁接触侵染昆虫的病原微生物。在害虫防治过程中，虫生真菌是替代传统农药的最佳选择，这是因为虫生真菌对人、畜、植物及环境安全，并能在适宜的环境条件下引起流行病，在自然调节昆虫种群过程中起着重要作用(Ali et al.，2010)。莱氏野村菌Nomuraea rileyi 属于半知菌亚门丝孢纲Hyphomycetes 丛梗孢目Miniliales 野村菌属Nomuraea 是一种世界性广泛分布的重要虫生真菌。其可以侵染30 多种鳞翅目害虫，尤其是对夜蛾科害虫，如斜纹夜蛾Spodoptera litura、甜菜夜蛾、粉纹夜蛾Trichoplusia ni、烟青虫Helicoverpa assulta、棉铃虫H.armigera等的致病力强，在自然界常常引发高强度的昆虫流行病，故受到各国科学工作者的重视(Srisukchayakul ＆ Pantuwatana，2005;Perinotto et al.，2012;Song et al.，2013)。和昆虫病毒、细菌必须摄入到昆虫体内不同，真菌可直接通过产生附着孢等特殊结构从害虫体壁侵入，在此期间会分泌蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶等多种酶(Santi et al.，2010)。在侵入后，菌丝体会利用昆虫体液进行生长、繁殖，同时产生的毒素及代谢物会干扰和破坏害虫的生理机能，最终导致害虫死亡(Schrank ＆ Vainstein，2010)。

我们从南京六合大豆田罹病斜纹夜蛾幼虫虫体上分离获得一株莱氏野村菌新菌株，测定了其对甜菜夜蛾的毒力，以期为进一步开发利用该菌开展生物防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、培养基与昆虫

实验用莱氏野村菌菌株于2013年9月在江苏省南京市六合大豆田罹病斜纹夜蛾幼虫虫体上分离得到。培养基选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。供试甜菜夜蛾幼虫为本实验室利用人工饲料饲养多年的室内种群。养虫条件为26℃，相对湿度75%，光照时间14 h。

1.2 试剂

基因组DNA 提取试剂盒说明书提取DNA 为Promega 公司产品，琼脂糖凝胶回收试剂盒为Omega Biotek 公司产品，pEASY T3 为Transgen 公司产品，LA Taq 聚合酶为TAKARA 公司产品，X-gal、IPTG、氨苄青霉素等为BBI 公司产品，其他常用试剂为国产分析纯。

1.3 菌株DNA 的提取及鉴定

将PDA 培养基培养好的莱氏野村菌分生孢子接种于液体培养基中，180 rpm，26℃，振荡培养72 h，将菌液转移至50 mL 无菌离心管中，10000 rpm离心10 min，收集菌体，依据基因组DNA 提取试剂盒说明书提取DNA。

1.4 菌株的ITS 鉴定

采用真菌核糖体rDNA 区通用引物ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')扩增ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 全序列及部分18S 和28S rDNA 序列。引物由上海生工合成。PCR 反应程序为:94℃预变性4 min;94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸60 s，共35 个循环;72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后，克隆到pEASY T3载体中，阳性克隆由南京金斯瑞公司测序。

1.5 菌株的扩繁及孢子计数

将莱氏野村菌接种在PDA 培养基上在人工气候箱26℃下培养10 d 供试验用。分生孢子液的制备:将分生孢子粉刮到一个三角瓶中，加入10 mL的0.05%吐温-80 及少量的玻璃珠，充分振荡后过滤，除去菌丝和杂质。利用血球计数板计数法，把分生孢子按照10×稀释法配成不同的浓度。

1.6 甜菜夜蛾幼虫接种感染方法

采用浸渍法接种甜菜夜蛾幼虫。用镊子将甜菜夜蛾3 龄幼虫放入待测莱氏野村菌分生孢子液中浸5 s，然后移入盛有人工饲料的六孔板中，每孔放置5 头，每处理120 头，重复4 次，以0.05%吐温-80 作为对照，连续观察8 d，记录死亡数。实验条件为26℃，光照时间14 h，施药后第一天相对湿度90%，之后为75%。

1.7 数据统计与分析

用几率值分析法，将虫体死亡率进行几率值转换后用DPS 进行显著性测验，并分别对剂量和时间作线性回归分析建立直线回归模型，分别估计剂量效应LC50和时间效应LT50。

2 结果与分析

2.1 菌株的ITS 鉴定

电泳结果在凝胶成像系统上观察、拍照，供试菌株目的片段长度约为600 bp (图1)。测序结果显示其长度为619 bp，其中31-182 bp、183-370 bp、371-561 bp 分别为ITS1、5.8S rRNA、ITS2。BLAST 分析发现其与莱氏野村菌的同源性高达99%，结合形态特征观察，确定其为莱氏野村菌Nomuraea rileyi。图2 为测序结果(GenBank登录号为KM396227)。

图1 真菌鉴定电泳图片Fig.1 Electrophoresis of amplified DNA fragment

2.2 莱氏野村菌对甜菜夜蛾幼虫的毒力

由表1 可知，第3 天出现少量死亡的甜菜夜蛾幼虫，孢子浓度为2.25×107个孢子/mL 和2.25×108个孢子/mL 时对幼虫的感染效果较好，第3 天就有幼虫死亡，5-8 d 的死亡率分别为76.67%、85.83%，87.50%、94.17%，93.33%、96.67%，97.5%、100%。孢子浓度为2.25×104个孢子/mL 的莱氏野村菌对甜菜夜蛾的感染效果较差，直到第5 天幼虫才开始死亡，而且到第8 天死亡率也不超过50%。

表2 和表3 表明，该菌对甜菜夜蛾幼虫有较高的杀虫活性，第5-8 天的LC50由3.6488×106降低到6.2180×104，而且差异显著，LC95也从6.6605×108降低到1.2714×106。在2.25×105-2.25×108个孢子/mL 浓度下的LT50随着浓度增加而逐渐缩短，即由7.4165 缩短到4.3292 d。

图2 莱氏野村菌ITS 及5.8S rRNA 序列Fig.2 The ITS and 5.8S ribosomal RNA sequences of Nomuraea rileyi

表1 莱氏野村菌分生孢子液对甜菜夜蛾3 龄幼虫的感染死亡率Table 1 Toxicity of Nomuraea rileyi to 3rd instar larvare of Spodoptera exigua

表2 莱氏野村菌分生孢子对甜菜夜蛾3 龄幼虫的致死中时Table 2 Median lethal time of Nomuraea rileyi to 3rd instar larvare of Spodoptera exigua

表3 莱氏野村菌分生孢子对甜菜夜蛾3 龄幼虫的致死中浓度Table 3 Median lethal concentration of Nomuraea rileyi to 3rd instar larvare of Spodoptera exigua

3 结论与讨论

在害虫防治中利用生物防治技术，可降低化学农药的使用量，减轻对环境的污染，保护利用天敌，促进自然抑制能力的发挥而降低虫口密度。目前使用的甜菜夜蛾的生物防治制剂包括苏云金芽孢杆菌、甜菜夜蛾核型多角体病毒等(吕善运等1997;郭慧芳等2003)，而真菌杀虫剂使用报道尚少，仍然处于研究阶段。本研究利用莱氏野村菌对甜菜夜蛾3 龄幼虫进行致病性测定，对其最高死亡率达100%，致死中浓度为6.2180×104个孢子/mL，当孢子浓度为2.25×108个孢子/mL 致死中时为4.3292 d。周立峰等(2012)测定的5 株莱氏野村菌对甜菜夜蛾的毒力偏低 (死亡率都未超过50%)，无法满足应用。朱春燕等(2011)测定的莱氏野村菌对甜菜夜蛾的LC50为2.43×105个孢子/mL，比本研究略高。因此，本研究获得的莱氏野村菌具有较大的应用前景。

真菌对害虫的寄生必须有一个最小数量的入侵单位与寄主接触，才能诱发疾病。如果低于这个数量，寄主就不能染病或者发病极低，起不到防治作用(包建中和古德祥，1998)。本研究中的莱氏野村菌在浓度为2.25×104个孢子/mL 时对甜菜夜蛾3 龄幼虫的毒力偏低，甜菜夜蛾第8 天的死亡率仅为43.33%，即便第14 天死亡率也未超过50% (未发表数据)。莱氏野村菌处理的甜菜夜蛾3 龄幼虫 LC50、LC95分别为2.1721×105、9.5152×107，田间防治的防效一般应在80% 以上，因此，莱氏野村菌用于甜菜夜蛾的防治浓度应在1×106以上。

本研究致病力试验还发现，甜菜夜蛾被莱氏野村菌菌株侵染后虫体发硬，初期在僵虫上产生白色菌丝，后期产生大量绿色的分生孢子。应当指出，上述莱氏野村菌处理前3 天，甜菜夜蛾幼虫的死亡率都很低，4 d 后防治效果明显提高。提高莱氏野村菌的杀虫速度是突破制约其广泛应用的一个关键点。

随着对食品安全问题的日益关注，国内外越来越重视害虫综合治理(IPM)，主张以生物防治作为综合防治的重要要素之一，而使用微生物农药是生物防治的手段。在各种杀虫微生物中，真菌因能持续控制害虫种群数量、生物安全性高、易于人工培养、生产成本较低等优点而在害虫种群控制方面具备很大的发展潜力，必将是21 世纪可持续发展的环境友好型的理想农药。

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