阿尔茨海默病的细胞及基因疗法研究现状

孔　迪，殷香宇，申龙健(综述)，王建秀(审校)

(哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科，哈尔滨 150001)



阿尔茨海默病的细胞及基因疗法研究现状

孔迪△，殷香宇，申龙健(综述)，王建秀※(审校)

(哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科，哈尔滨 150001)

摘要：阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病,尽管过去对AD治疗的研究有了长足的进步，但是仍然缺乏长期有效的治疗办法。目前，药物治疗和外科手术治疗仅起到缓解AD症状的作用，仍不能阻止病情的发展或者恢复受损的神经功能。而细胞替代疗法和基因疗法治疗AD成为可能，并逐渐成为AD治疗的研究热点，同时也为AD的治疗带来了新的希望。

关键词：阿尔茨海默病；神经干细胞；间充质干细胞；基因治疗

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是以进行性认知功能障碍和行为损害为主要特征的神经退行性疾病。起病缓慢进行性发展，预后差。其发病率随年龄增长而上升，据统计美国超过65岁的人群AD发病率占10%，超过85岁人群中占50%[1]。研究显示，成体的某些脑组织如侧脑室壁的室管膜下区和海马齿状回颗粒下带的神经上皮干细胞蛋白表达阳性，表明存在神经再生现象[2]，而成体内源性干细胞数量较少，不足以修复中枢神经系统功能。因此,替代丢失及损伤的神经元以恢复其功能，进而延缓病程进展是治疗这类疾病的新思路。现对AD的细胞及基因疗法研究现状予以综述。

1AD的发病机制

β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)是老年斑的主要成分，神经细胞外Aβ的异常沉积是AD的主要病理学特征之一[3]。Aβ是其前体淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)分解而成的一个肽段。APP是神经元产生的正常蛋白，起促进和支持神经细胞生长作用。正常情况下的Aβ产生和降解是平衡的，AD产生的多种因素造成了Aβ的异常沉积。相关研究采用显微学方法观察了Aβ的不同聚集形态，探讨了其与AD发病机制的关系[4]。其毒性机制为：Aβ和其他蛋白形成Aβ纤维，导致细胞外自由基出现，引起神经元细胞膜通透性增加，大量Ca2+涌入细胞内，依次激活钙依赖性激酶、蛋白酶、脂肪酶，细胞内自由基生成，从而导致细胞损伤乃至死亡[5]。AD的第二特征蛋白Tau蛋白是一种微管蛋白，起维持微管稳定性的作用[6]。神经元纤维缠结主要与Tau蛋白异常高度磷酸化有关。高度磷酸化的Tau蛋白自发凝聚成双股螺旋丝导致神经元纤维缠结形成，同时微管的扭曲变性使其不能正常输送营养物质，导致神经元末端的树突和轴突发生营养不良性萎缩[7-8]。到目前为止，AD确切的发病机制尚不清楚，存在胆碱能受损、神经细胞钙平衡失调、炎性损伤等多种假说。

2AD的非药物治疗

目前，AD的药物治疗有15大类，主要有胆碱酯酶抑制剂和门冬氨酸受体拮抗剂等，但没有任何一种药物能治愈AD。近年来，很多学者投入到改善症状或减慢神经病理学进展的非药物治疗方法的研究中[9-11]。其中，细胞替代疗法和基因疗法的出现为AD的治疗提供了新的思路。

2.1干细胞移植疗法

2.1.1胚胎干细胞移植疗法当受精卵分裂发育成囊胚时，将内细胞团分离出来进行培养，即可得到胚胎干细胞[12]。有针对性地诱导胚胎干细胞定向分化成不同种类的细胞，如神经干细胞(neural stem cell,NSC)、骨髓间充质细胞(mesenchymal stem cel1s,MSC)或其他种类的细胞，这些细胞可用于细胞替代疗法。然而胚胎干细胞移植后易产生非转移性良性畸胎瘤甚至免疫反应[9]，而且这种分化无序、不受约束甚至面临伦理学的束缚，试验研究难以展开。

2.1.2NSCNSC可来源于胚胎干细胞和成年干细胞。前者需从胚胎获取干细胞，因而面临伦理学的束缚。对于未来临床应用，成年来源的NSC更具可行性。成年来源的NSC包括存在于成年神经组织中的干细胞和从其他组织中分化得到的干细胞。NSC被称之为能自我增殖的多能干细胞，可以分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞[10]。NSC首先在成年大鼠室管膜下区和海马齿状回颗粒下带被发现。NSC分化成神经细胞并从室管膜下区迁移到嗅球，在这里形成成熟神经元并参与嗅觉的形成。海马齿状回颗粒下带的NSC迁移并分化成海马区的神经元，这就意味着海马齿状回颗粒下带的神经再生对于记忆力至关重要[11]。AD患者存在记忆力下降及气味辨别缺陷的症状，表明病理学的进展可能影响到神经元的再生。以上病理改变也为细胞移植的可行性提供了理论依据，即将体外扩增的NSC移植到脑内，以替代丢失、受损的神经元，从而修复神经系统的功能。NSC移植治疗AD的可能机制如下：NSC能分化成临床所需神经样细胞、分泌营养因子、促进内源性修复、刺激血管再生、作用于炎性细胞[13]。

很多研究已成功将干细胞疗法[14]应用到治疗AD。Qu等[15]的研究显示，将NSC移植入有记忆力损伤的成年AD鼠的侧脑室，结果AD大鼠的认知功能得到明显改善。同时证明，移植入脑内的NSC已经成功分化成神经元和神经胶质，并迁移到不同的大脑区域。Blurton-jones等[16]研究阐明移植NSC需要一些因子参与。将NSC移植入成年三重转基因小鼠海马，成功地改善了它们的空间学习及记忆能力。除此之外他们还发现在突触集中区域有高水平的脑源性神经营养因子表达，表明在NSC移植中，NSC分泌的脑源性神经营养因子对于认知功能的改善至关重要。研究表明，NSC移植联合转基因加上持续的营养因子支持具有成功治疗AD的可能性[17]。通常认为AD患者出现痴呆及记忆损害的表现主要与脑基底核部位的损伤有关，该部位存在胆碱能神经元。将一种源自胎龄14日胎鼠海马趾原基的永生化NSC系MHP36细胞注入前脑胆碱能损伤的AD模型内，发现外源性干细胞主动迁至损伤区域，分化为神经元和胶质细胞，重建锥体细胞层的大体结构，鼠认知功能恢复。该研究说明外源性MHP36细胞能在损伤部位替代胆碱能神经元[18]。

很多动物实验证实NSC可被成功体外培养，移植后的NSC能存活、分化和迁移[11]。但是AD移植治疗存在的最大挑战就是缺乏自体同源性的干细胞。对于人脑神经元能否识别这些细胞，研究者仍存在一些顾虑。而且，AD移植治疗需要克服因长期培养神经干细胞带来的转染和稳定分化相关问题。Wu等[19]在人胚胎NSC体外培养增殖过程中增加了一个新的步骤，能促使其在体内微环境中几乎完全诱导分化为神经元。将处理后的NSC移植入成年鼠中枢神经系统内，发现其在微环境诱导下可获得胆碱能神经元表型，使NSC移植治疗从单纯移植向功能性移植向前迈进了一步。但最关键的问题是怎样在特定损伤部位定向诱导NSC分化为胆碱能神经元。目前，在体外、体内对NSC的定向诱导分化尚未得到很好的解决，而且移植到体内后能否获得成熟神经元的全部特征，目前也没有研究定论。另外AD的发病机制目前尚不完全清楚，它的病理状态(如高Aβ)是否会影响外源性NSC的增殖分化，如何避免这种影响，均有待进一步的研究与解决。NSC移植治疗从基础研究到临床应用还有相当的距离，但确为AD治疗开辟了新途径，应用前景深远。

2.1.3MSCsMSCs是近年来才被确认的非神经元成体干细胞。MSCs源于中胚层，易于培养、扩增，具有多向分化潜能，在一定的环境和条件下可以分化为多种细胞，如成骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、心肌细胞等[10]。MSCs已经被证实在体内外均可分化成神经元及神经胶质细胞[10]。同时MSCs来源丰富、取材简便、自体移植避免了伦理问题和免疫原性反应，这些特征使其成为细胞替代治疗比较理想的方法。

近年来，国内外学者应用不同来源的MSCs进行了大量研究并取得一定结果。Lee等[20]将来源于骨髓MSCs移植入APP/PS1转基因小鼠的海马内移植导致了内源性小胶质细胞/巨噬细胞的活化，并观察到Aβ、过度磷酸化Tau蛋白的减少，小鼠空间学习能力及记忆力得到改善。人类脐带血MSCs也已经被移植到急性期AD小鼠模型内[21]。在双重转基因小鼠体内，这些细胞的植入同样减少了Aβ及Tau蛋白的沉积，改善了小鼠的空间学习及记忆力。这些效果与小胶质细胞分泌的炎性因子的水平下降有关。尽管人类脐带血MSCs移植非常具有前景，但脐带血间充质干细胞缺乏与其他类型MSCs的对比性研究，未来的研究有必要解决这一问题。

2.2基因治疗移植前干细胞的基因修饰可以提高细胞的生存率及有效率[22]。如前所述，AD患者的胆碱能神经元存在丢失，针对这一问题，有学者致力于研究能产生乙酰胆碱的基因修饰细胞。原始的成纤维细胞系基因工程表达胆碱乙酰转移酶证明了移植入小鼠海马后有产生乙酰胆碱的能力[23]。在AD的基因治疗中，其应用是过度表达Aβ降解酶，从而改善细胞外的淀粉样蛋白沉积，这已经被有关研究证实[24]。表达Aβ降解酶的转基因小鼠证实了Aβ沉积的减少并且证实了表达Aβ降解酶的转基因MSCs有体外降解Aβ沉积的能力。将转染慢病毒载体Aβ降解酶的原始成纤维细胞移植入转基因小鼠也获得类似结果。Wu等[17]的研究证实了表达hNGF的基因改良NSCs能够融入机体内并代替损伤或丢失的神经细胞。此外，有研究将载有hNGF基因的成纤维细胞植入8例AD患者前脑中，在第一临床试验阶段患者认知功能减退发生率有所改善[25]。由腺病毒增强神经生长因子表达的第二临床试验阶段也正在进行中[26]。

虽然目前基因治疗AD仍面临很多问题，如基因表达的安全性、稳定性、有效性等，但随着对基因表达调控机制研究的深入及相关技术方法的完善，相信基因治疗将会成为一种治疗AD的新的重要方法。

3小结

虽然细胞替代疗法和基因疗法应用于临床仍面临许多困难，临床应用试验已在进行，尽管细胞存活率、免疫反应及手术治疗的挑战仍然需要解决，但是近年来取得的研究进展已经为AD的治疗带来了新的希望，具有传统药物治疗和外科手术治疗不可比拟的优势。近年来国内外学者对AD细胞及基因疗法也进行了大量的研究，并取得了一定的成果，相信随着研究的深入，必将为AD的治疗带来更多的希望。

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Research Advances in Cell and Gene Therapy for Alzheimer DiseaseKONGDi,YINXiang-yu,SHENLong-jian,WANGJian-xiu. (DepartmentofInternalNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract：Alzheimer disease(AD) is a neurodegenerative disease. Although the treatment of AD has made great progress, there is still no long-term effective treatment for this disease.At present,drug therapy and surgery can only alleviate the symptoms of AD,which cannot halt the progression or restore the damaged neural function.And the stem cell treatment and gene-modified therapy have become technically feasible, and gradually become a focus in the therapeutic strategies for AD,which has brought hope for the treatment of AD.

Key words:Alzheimer disease; Neural stem cell; Mesenchymal stem cell; Gene therapy

收稿日期：2014-12-08修回日期：2015-03-05编辑：相丹峰

基金项目：黑龙江省卫生厅科研课题(2009-067)；哈尔滨医科大学附属第一医院院基金(2009B16)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.013

中图分类号:R741.05

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)18-3299-03