外排体的研究概况

贺继刚(综述),王　平,李洪荣(审校)

(云南省第一人民医院心脏大血管外科，昆明 650000)



外排体的研究概况

贺继刚(综述),王平※,李洪荣(审校)

(云南省第一人民医院心脏大血管外科，昆明 650000)

摘要：近年来，多项研究表明外排体(Exosome)是从细胞上产生的鳞片状脱落的囊泡，具有胞外酶的活性。最初认为它仅仅起到一种“垃圾袋”的作用，允许细胞丢掉不需要的蛋白。当内涵体和细胞膜相互融合并且释放Exosome进入细胞间隔。这些囊泡体从细胞内释放出来，它们就被认为是Exosome。现证实它来源于细胞后期内涵体，并且可以在造血干细胞和上皮细胞的培养基中检测到。Exosome具有多种生物学功能，它可以使得细胞在不需要直接接触下完成细胞间生物信号转导，其在细胞保护、免疫、疾病诊断等方面成为目前研究的热点。

关键词：外排体；细胞保护；免疫；疾病诊断

外排体(Exosome)是小的膜性囊泡，从20世纪90年代起受到极大关注[1-2]。此词于1981年首先提出，是从细胞上产生的鳞片状脱落的囊泡，具有胞外酶的活性[3]。Exosome所含的蛋白及脂质可能是其生物学功能主要部分。Exosome是由专业的抗原呈递细胞(即B型淋巴细胞及树突细胞)所分泌的，它富含组织相容性Ⅰ类及Ⅱ类复合体、共刺激分子及热激蛋白(heat shock protein,HSP)70～90伴随分子，因此它可以调节体内的免疫功能。作为细胞分泌的一种特殊囊泡，它能够使细胞间得以交流。在最近5年内，有超过1500篇有关“Exosome”的文章可以在Pubmed上被检索到，而且囊泡协会有超过700个单位加入[4]。现对Exosome的定义、分离、生物学特征等最新进展予以综述。

1Exosome的分离

目前对Exosome的分离包括超速离心[5]及超滤。而应用最广泛的是根据样本浓度采用的超速离心。首先通过低速离心去除细胞，而后再以100 000×g～110 000×g的速度离心，获得Exosome。许多研究人员亦使用蔗糖离心法分离Exosome，由于Exosome溶解于蔗糖的密度为1.13～1.19 kg/L[6]。Cheruvanky等[7]报道，使用超滤纯化Exosome比超速离心花费时间少，而且不需要特殊设备。目前的Bioo Scientific试剂盒可以移除血小板、细胞碎片及细胞而后纯化Exosome。而System Biosciences的ExoQuick能够加入到血清、细胞培养基及尿液中沉淀Exosome[7]。虽然这一过程是非常快而且直接，但无法避免的是对Exosome仍缺乏特异性，而且对来自血清中的颗粒很难重新滤去。

2Exosome的检测

Exosome的电子显微镜结构为直径≤130 nm。双层脂质结构，厚度大约为5 nm，由于Exosome 从内涵体(200～500 nm)以“出芽”方式形成，固它们最大直径为100 nm[5]。所有的Exosome 都包括膜转运体、溶质蛋白(GTpase)、四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD8、CDS2)、HSP70、HSP 90、囊泡生成蛋白、磷脂相关蛋白及磷脂[8-9]。生理学上Exosome与胞质小体相似，为脂质双层富含磷脂酰丝氨酸、神经酰胺和鞘磷脂[10-11]。而跨膜蛋白包括4个区的跨膜蛋白。而CD9、CD61、CD82能够表达在Exosome 上，它们可以作为一个稳定的标志性分子识别Exosome[12-15]。 此外，也有与Exosome相关的免疫分子，如主要组织相容性抗原[16]、T细胞共受体CD86[17]。对提纯的Exosome 可以采用HansaBiomed进行检测，其提供了一系列的产品统称为ExoTest试剂盒，可以用于检验CD63、CD81或CD9抗体[16]。

由于Exosome除包括蛋白质亦包括着RNA。许多文献指出Exosome所 “转运” 的RNA不同于母体细胞，即Exosome所含某种RNA通过裂解母体细胞无法检测到[18-20]。由于许多肿瘤学家发现，原始癌细胞所含特殊微RNA(microRNA，miRNA)存在于循环Exosome中，因而可将Exosome作为肿瘤检测的标志分子[21-22]。

3Exosome的生物学特征

3.1Exosome基本生物学作用对于许多细胞而言，Exosome更像是一种细胞分泌或代谢的产物，它可以为细胞扔掉不需要的蛋白及RNA，Exosome的释放取代了裂解过程对于细胞是有利的，细胞并不需要高效的降解能力或者诸如像肾脏的那样排泄管道[23]。

3.2Exosome免疫学作用目前，对于Exosome调节免疫系统的能力进行了大量研究。当细胞暴露于一种应激条件下，它能够通过释放7×103的HSP72调解内在免疫系统[24-25]。而最新的研究表明，当暴露于应激条件下能够改变与免疫有关的miRNA，但目前还不清楚应激诱导下的HSP72和miRNA是怎样释放到循环中的，它们是怎样和内源性免疫细胞相作用的[24]。各种研究也证实，在Exosome上有HSP72和miRNA的出现[25]。Beninson和Fleshner[26]认为：①Exosome可以调节免疫系统；②Exosome易受环境应激的影响；③暴露于应激下首先激活内源性免疫系统及与Exosome相关的应激敏感性蛋白及miRNA，预计应激可以改变Exosome的组成，从而调节组织的免疫。在Exosome中富含的miRNA可以通过和信使RNA(mRNA)的5′末端相连接阻止目标基因的表达，miRNA不是通过和mRNA互补以阻止转录。因此，一条miRNA能够和数条mRNA相互作用，而阻止蛋白的表达。

目标miRNA进入内涵体的机制还没有被完全理解，当“母体”细胞暴露于各种应激条件下，其Exosome内的miRNA都可能会发生改变。最近的研究表明，Exosome内的miRNA并不是随机选择的，而是环境选择的结果[27]。因此，与诱导mRNA静默复合体相关的miRNA可以通过Argonant蛋白、HSP90进入Exosome[27]。

3.3Exosome免疫分子表达Exosome可以表达表面黏附分子，而被受体细胞捕获。例如，由树突状细胞释放的Exosome含有细胞黏附分子1，并且能够和它们的配体、位于淋巴细胞及白细胞表面的淋巴细胞功能相关抗原1相配[26]。此外，由网织红细胞[27]、树突细胞[11]及T细胞[23]分泌的Exosome可以表达β1和β2整合素，它允许Exosome与细胞表达的细胞间黏附分子1或纤维连接蛋白相匹配，一旦和受体细胞相作用，Exosome就可以将其内容物转移至细胞内[28]，或是通过表面受体激活细胞[13]。

3.4Exosome免疫作用的途径由抗原呈递细胞分泌的Exosome 可以通过表面表达的补体抑制蛋白CD55和CD59抑制补体介导的裂解[16-17]。这样通过Exosome可以对分泌的蛋白、miRNA进行保护，不被降解，其所载蛋白及miRNA可以通过黏膜屏障或细胞间环境，形成细胞间的远距离交流并且不需要细胞与细胞的直接接触。

从B细胞及树突状细胞分泌的Exosome富含组织相容性抗原[29]和T细胞共刺激分子[17]。目前研究证实，Exosome通过许多机制促进内源性免疫。例如，来源于病原体感染的真核细胞产生的Exosome展示了各种促炎功能，被巨细胞病毒感染的巨噬细胞所分泌的Exosome可以通过其表达的脂体与未感染的巨噬细胞Toll样受体相匹配，通过激活核因子κB途径刺激转录和前炎性细胞因子肿瘤坏死因子α的分泌[29]。Exosome表达高水平的HSP70是一个应激激活蛋白，这一研究也对在应激状态下的Exosome检验提供了支持。

Exosome通过miRNA调控内源性免疫。受脂多糖影响的巨噬细胞可以上调细胞间miR-155及下调miR-125并且通过B细胞κ 轻肽基因增强子核因子抑制因子ε和肿瘤坏死因子α激活增强免疫[26]。其他的与Exosome相关的miRNA也能够通过Toll样受体介导炎症反应[24]，增加前体炎性因子的表达[30]和巨噬细胞分化[31]。基于这些发现可以认为，Exosome中的各种miRNA是机体处于应激期检测免疫功能的理想指标。

3.5Exosome的应激保护作用在应激情况下，身体中主要的轴被激活：下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感神经轴。在应激情况下，应激相关分子的分泌对于调节内源性免疫是关键，组织受损或暴露于病原体时应激相关分子被认为是一个预警信号并可以促使组织存活。例如应激相关分子可进入受损组织[32-33]，在应激相关分子中含有HSP特别是HSP72，当暴露于各种受损因子时，其可以促进前炎性因子生成，并且表达于Exosome上，这使得HSP72成为在应激时检测Exosome最佳指标。例如在没有疾病情况下，某些应激如大鼠尾部受损[25]，加热、剪切[34],这些均不能导致HSP72的上升。此外，HSP72可以诱导巨噬细胞中的一氧化氮合酶，因此可以增强它们的杀菌活性。在这种情况下HSP72扮演着促炎反应因子的角色。许多研究表明，HSP72在Exosome上密集表达，在应激反应下Exosome大量表达，说明在应激反应下基于Exosome 增强的免疫可能为一种关键成分，即可以增强免疫[2,26,35]。这些研究也展示了当暴露于应激下，循环中的Exosome 可以发生改变。

研究亦表明，在应激情况下通过修饰血浆中Exosome上的HSP72能够激活Toll样受体通过抑制miR-142-5P可以上调gp130基因表达，并且抑制socs3活性并下调miR-203激活MyD88[36]。与应激相关的Exosome的HSP72和miR-142-5p可能涉及去甲肾上腺素，可以激活α1-ADR。活化后α1-ADR可以启动G蛋白偶联受体从而激活细胞磷脂酶C[36]。

总之，Exosome是重要的炎性介质，它们在应激状态下的作用与免疫功能密切相关。在各种疾病和体外环境下它们的组成、功能均会发生改变。

3.6Exosome的缺血/再灌注损伤的保护Exosome不但有免疫调节作用还有减轻心肌缺血/再灌注损伤的效果。Timmers等[37]报道，为了更好地理解Exosome的心肌保护作用，他们将间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)培养基采用滤膜将其内部成分系统性的分为各个等级大小，表明具有心肌保护成分为>1000 kPa。即心肌保护是由直径为50～100 nm的囊泡所介导的[37]。MSCs营养改善心肌缺血已有大量研究，据Tang等[38]报道MSCs进入缺血心脏，可以减少组织反应，增加血管生成及减少细胞的凋亡，相比用MSCs转分化，其旁分泌可以更好地解释这些效果。迄今为止，总是将MSCs的旁分泌局限于细胞因子、化学因子及介导于细胞间信号的生长因子。而Exosome的出现从根本上改变了当前对MSCs旁分泌的理解。据Chen等[39]报道，MSCs分泌的Exosome可以改善缺血/再灌注损伤，其在狭小心肌修复窗内，通过在细胞间快速传递功能性蛋白和miRNA而启动细胞修复。Exosome含有的miRNA主要为一些前体形式。推测在心肌保护中Exosome的介入可能代表着其发挥着重要的组织修复功能，也有可能不同的细胞其分泌出不同的Exosome，而修复不同的组织。

4Exosome的诊断

Mitchell 等[40]报道血清中miR-141是由前列腺癌细胞所产生，依靠其可以从健康人群中筛查出前列腺癌的患者。该研究证实循环中的Exosome内含有miR-141，依靠Exosome可以从健康人群中筛查出前列腺癌的患者。

而Gilad等[41]报道，怀孕妇女血清内有已胎盘相关的miRNA(miR-526a，miR-52)，miR-515-5p、miR-521在怀孕期间水平有明显提高，而它们的水平与怀孕阶段有明显关联性，在怀孕期间可以出现在循环内的Exosome中，从而可以明确怀孕。

5Exosome的临床应用

进入2000年以来有许多Exosome有关的Ⅰ期临床试验。①法国使用来源于异体树突状细胞分泌的Exosome为疫苗治疗远处转移的淋巴瘤患者[42]。②英国使用Exosome治疗非小细胞性肺癌的患者。根据报道树突状细胞细胞分泌的Exosome 大规模生产是可行的，在临床试验中其治疗具有很好的耐受性[43]。③中国使用异体腹水来源的Exosome结合集落刺激因子治疗结肠癌起到了良好的效果[44]。

6结语

大多数研究已证实Exosome是从细胞上产生的鳞片状脱落的囊泡，具有多种生物学功能，它可以使得细胞在不需要直接接触下完成细胞间生物信号转导，其在细胞保护、免疫、疾病诊断等方面具有明显作用，但具体的作用机制尚不明确。Exosome是通过何种途径对免疫细胞或免疫反应通路产生影响的具体机制值得进一步探究，进一步明确Exosome的作用机制能为免疫治疗提供新的作用靶点，也能为Exosome临床应用提供较好的理论基础。

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Research Surgery of ExosomeHEJi-gang,WANGPing,LIHong-rong. (DepartmentofCardiacVascularSurgery,YunnanFirstPeople′sHospital,Kunming650000,China)

Abstract:In recent years,several studies have shown that exosome is vesicle shed from the cell with the extracellular enzyme activity. It was initially believed to play a "garbage bags" effect,allowing the cells to lose unwanted proteins.When endosomes and the cell membrane merge and release vesicles into the cell interval.These vesicles released from the cells are considered exosome. Now it is confirmed to have derived from late endosomes,and can be detected in hematopoietic stem cells and epithelial cells in culture medium.Exosome has a variety of biological functions, it can make the cell to complete the biological signal transduction between cells without direct contact,and it has become a hot research in cell protection,immunization,and disease diagnosis.

Key words:Exosome; Cell protection; Immunity; Disease diagnosis

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-02-27编辑：相丹峰

基金项目：国家自然科学基金(81460073)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.006

中图分类号:R379.9

文献标识码:A

文章编号：1006-2084(2015)18-3280-04