利用基因芯片筛选烤烟早花基因初探

杨静 ,陈杰 ,陈建军 ,邓世媛 ,邱妙文 ,赵伟才 ,王维

1 黔东南州烟草公司镇远县分公司，贵州镇远 557700；

2 华南农业大学农学院，广东广州 510642；

3 黔东南州烟草公司，贵州凯里 556000；

4 广东省烟草南雄科学研究所，广东南雄 5124002

利用基因芯片筛选烤烟早花基因初探

杨静1,2,陈杰3,陈建军2,邓世媛2,邱妙文4,赵伟才4,王维2

1 黔东南州烟草公司镇远县分公司，贵州镇远 557700；

2 华南农业大学农学院，广东广州 510642；

3 黔东南州烟草公司，贵州凯里 556000；

4 广东省烟草南雄科学研究所，广东南雄 5124002

为研究与烟草早花有关的基因，本试验利用安捷伦烟草全基因组基因芯片对烤烟品种K326及其抗早花变异系华烟06、K326LF花芽分化过程茎尖端基因表达谱进行分析，筛选出其中与花芽分化可能有主要关系的基因：AGL20、CCR2、ELF4、ERD7、CBF1、COR413-PM1、EMF2、VIP4、COL1、AGL17、COL9、FPA、SWN等，其中 COL2、ELF4的表达差异达到了5倍；AGL62、CBF1、SWN、NAP与FPA的差异大于或等于10倍。该试验可为进一步研究烟草抗早花机理及培育抗早花新品种提供参考。

烤烟；早花；抗早花；基因芯片；基因

烟草是以收获叶片为目的的经济作物，发生早花的烟株由于过早地从营养生长转入生殖生长，烟株生长势弱、叶数少，叶片窄小、叶片的产量和质量降低[1,2]。拟南芥开花基因的研究开启了植物开花基因研究的大门，通过对拟南芥开花基因同源基因的搜寻，水稻、谷物、果树中与开花相关的基因的研究也已取得了很大的进展，与开花相关的基因相继被克隆[3-5]。Smykal等人[6]从烟草中克隆了与开花时间相关的基因Nicotiana SOC1(NtSOC1)和Nicotiana FUL(NtFUL)，并经过试验表明它们与光周期特性有关，过表达能引起烟草提早开花。李元元根据不同植物MADS-box家族基因的保守区序列，设计简并引物，从烤烟品种NC82中克隆出了MADS-box家族的同源基因[7]。王小彦等[8]通过低温等处理烟草后，分析了低温诱导烟草早花中的SOC1以及一些与代谢相关的酶、部分植物生长物质的基因表达变化。李爽等人[9]在烟草中转入小黑杨PsnAP1基因，转基因烟株提早开花。有研究发现，烟草中PtGT1 基因过表达会导致植株早花[10]。孙颖等人利用RNA-seq技术对油桐2个不同发育时期的花芽的转录组进行比较分析，搜寻出103个开花相关基因[11]。随着绒毛状烟草和林烟草全基因组序列图谱的完成和全球第一套烟草全基因组基因芯片制作的完成[12,13],烟草基因组研究已迈开步伐[14]。本研究选用Agilent烟草全基因组表达谱芯片检测烟草早花及抗早花品系花芽形成过程中成千上万个基因的表达情况。通过比较基因表达的差异，分析早花品种与抗早花品系在花芽形成机理上的不同，筛选出与抗早花可能有主要关系的基因，以期为进一步研究烟草抗早花机理及培育抗早花新品种提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料种植及采样

本试验选用烤烟品种K326及其抗早花变异系华烟06、K326LF作为材料。为了使易早花品种K326与其抗早花品种（品系）华烟06和K326LF的开花时间差异更明显，试验播种时间比生产上正常播种期提前20天，使烟苗前期充分感受低温胁迫。漂浮育苗，成苗后移栽至大田，并于移栽后第20天开始对各品种茎尖端进行花芽分化观察、适时取样，每个采样点取三个茎尖端混合提取RNA作为重复，并且标记好各样品代号。按照上海生物芯片有限公司提供的采样指南，所采样品用液氮固定后冷冻保存（-80℃）备用。采样时间及试验材料代号如下：

1.2 RNA的抽提和纯化

采用TRIZOL Reagent (Cat#15596-018,Life technologies,Carlsbad,CA,US)，抽提所得total RNA质检合格后使用RNeasy mini kit (Cat#74106,QIAGEN,GmBH,Germany)和 RNase-Free DNase Set(Cat#79254,QIAGEN,GmBH,Germany)纯化。试验样品RNA采用试剂盒Low Input Quick Amp Labeling Kit,One-Color (Cat#5190-2305,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)和标准操作流程对样品total RNA中的mRNA进行放大和标记，并用RNeasy mini kit (Cat#74106,QIAGEN,GmBH,Germany) 纯化标记后的cRNA。

1.3 芯片杂交扫描

按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，Gene Expression Hybridization Kit(Cat#5188-5242,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)杂交，并在洗缸staining dishes (Cat#121,Thermo Shandon,Waltham,MA,US)中洗片。完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner (Cat#G2565CA，Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)进行扫描。

1.4 基因芯片数据分析

扫描数据采用Gene Spring Software 11.0 (Agilent technologies,Santa Clara,CA,US) 进行归一化处理，所用的算法为Quantile。归一化的数据根据试验设计两两比较（表1），计算倍数差异Fold Change（FC）=SignalA/ SignalB，算法为 2（归一化A-归一化B）。登陆上海伯豪生物服务在线网站(http://www.shanghaibiotech.com/)，利用在线SAS系统进行数据分析。通过GO（Gene Ontology）分析对两倍以上的差异表达基因进行功能注释，结合NCBI中的基因信息选出可能与开花存在主要关系的基因，分析差异倍数并做聚类分析。

表1 基因芯片检测结果比较Tab.1 Comparison of gene chip detection results

1.5 荧光定量 PCR验证

利用烟草Actin基因(AB158612)为内参,从基因芯片分析结果中随机挑选出5个与开花相关的基因，进行实时荧光定量PCR,三次重复，反应条件为95℃，10min；接着进行40个循环：95℃，15秒；60℃，30 秒。算法为 log22-ΔΔCt。

2 结果

2.1 纵向比较中与开花相关的差异基因表达

2.1.1 各品种（品系）花芽分化过程中开花相关基因的表达

K326花芽未分化和分化相比较，对外界刺激应答的相关基因和生殖发育过程相关的具有功能注释的差异基因28个，其中上调的有7个，下调的有21个；表达差异在10倍以上的相关基因有5个，其中上调的有1个，下调的有4个。K326花芽分化与分化后五天相比，表达差异在两倍以上的，与开花、抗寒及干旱胁迫可能有主要关系的基因有18个，其中上调的有11个，下调的有7个；10倍以上的相关基因有5个，1个下调，4个上调。华烟06未分化1与未分化2相比与开花相关的差异基因有15个，其中上调1个，下调14个，2倍差异的有6个，3倍差异的有4个，4倍、5倍的均有1个，10倍以上的有3个。未分化2与分化相比，与开花相关的差异基因有16个，其中上调10个，下调6个，2倍差异的有6个，3倍差异的有5个，4倍、5倍、6倍的均有1个，8倍的1个，10倍以上的有1个。K326LF未分化与分化相比与开花相关的差异表达基因有16个，其中上调10个，下调6个，2倍差异的有11个，3倍差异的有1个，5倍、6倍、7倍的均有1个，10倍以上的有1个。

表2 各品种（品系）花芽分化过程中开花相关基因的表达Tab.2 Expression of flowering related genes of various varieti es (strains) in flower bud differentiation process

2.1.2 各品种（品系）纵向比较中开花相关差异表达基因的异同

由表3可以看出，在三者的花芽分化过程中，促进开花的基因AGL20[15]在K326、华烟06及K326LF花芽分化过程中均有表达且不断上调，说明其对烟株开花具有重要的调控作用。AGL17过表达会导致植株早花[16]， K326在未观察到花芽分化时AGL17已大量表达，这与其早花也许存在着一定的关系。EFL4这个与昼夜节律相关的基因也随着环境变化在三者中表达情况一致；与环境胁迫相关的基因COR413-PM1和COL1在三者中调控方向一致；其他基因的表达水平在不同品种（品系）中存在差异。

表3 各品种（品系）花芽分化过程中共有的差异的基因的表达Tab.3 Expression of differential gene shared by various variet ies(strains) in flower bud differentiation process

K326、华烟06及K326LF花芽分化过程中共同出现两倍以上差异表达的基因有AGL20，CCR2，ELF4，ERD7，CBF1，COR413-PM1，EMF2，VIP4，COL1。将K326、华烟06及K326LF花芽分化过程中与开花相关的差异基因表达的异同归纳如下：

图2 K326、HY06、K326LF 花芽分化过程中与开花有关的基因Fig.2 Flowering related genes of K326,HY06,K326LF in flower bud differentiation process

2.2 横向比较中与开花相关的差异基因分析

2.2.1 K326分化当天各品种（品系）间与开花相关的差异基因

K326分化当天， HY06和K326LF同时采样，与K326相比较，基因芯片中检测到的差异在2倍以上的与开花相关的基因表达情况归纳为表4。其中K326（1.1.8J）中与开花相关的基因大多相对华烟06（1.2.8J）和K326LF（1.3.8J）上调，华烟06中大多数开花相关的基因相对K326LF下调。

表4 K326花芽分化当天各品种（品系）间开花相关的基因表达Tab.4 Expression of flowering related genes of various varieti es (strains) in K326 flower bud differentiation process

2.2.2 K326、华烟06、K326LF分化时相比与开花相关的差异基因

HY06、K326LF与K326分化时，具有两倍及两倍以上差异的与开花相关主要基因的差异情况归纳为表5，其中K326（1.1.8J）相对华烟06（1.2.12J）和K326LF（1.3.13J），大量与开花相关的基因上调。

表5 各品种（品系）分化时与开花相关的差异基因Tab.5 Flowering related differential genes of various varieties (strains) in flower bud differentiation process

2.3 与开花相关的基因的聚类分析

利用SAS在线系统对挑选出的与开花有着主要关系的基因探针进行Heatmap运算，所得结果如图3所示，图中红色区域表示基因上调，绿色区域表示基因下调，黑色表示表达无变化。由聚类结果可以看出，对所采样品而言，样品1.1.8J，1.2.8J，1.3.8J的基因表达最相近，即K326花芽分化当天所采样品的基因表达相接近；1.1.2J与1.2.6J的基因表最相近，即距离K326花芽分化19天时所采的K326茎尖端样品与距离华烟06花芽分化19天时所采的华烟06茎尖端样品基因表达最相近。从开花相关的主要基因来看，AGL20，AGL24，AGL17这三个 MADS-box家族基因与VRN2的聚类结果相近。

图3 各品种（品系）开花相关的主要基因聚类分析Fig.3 Cluster analysis of the main flowering related genes of various varieties (strains)

2.4 芯片数据有效性分析

为了验证芯片分析结果，随机挑选了5个与开花有关并具有代表性的差异基因（CCR2，ELF4，AGL20，CBF1，COL9）进行荧光定量PCR验证。荧光定量PCR所用材料与基因芯片的材料及处理方式完全一样。从检测结果中随机选择15个比较项进行数据分析，表明验证结果与芯片试验结果虽存在一些差异，但总体上基本一致，芯片杂交获得的基因表达谱信息具有较高的可靠性。

图4 芯片数据与 Real Time-PCR 结果对比Fig.4 Comparison of gene chip data and Real Time PCR results

3 讨论

从表2可看出，在华烟06和K326LF花芽分化过程中，与开花相关的基因表达具有一定的偏向，整个分化过程中呈大部分上调或者大部分下调；K326花芽分化过程中与开花相关的差异基因不仅种类多，而且既有一部分上调，同时又有一部分下调，没有出现偏向表达。

由表4和表5可以看出，同一天采样的基因表达相比较差异基因少（表4），虽然茎尖端处于同一种状态（表5），但是由于采样日期不同，各样品间相比差异基因较多。这可能与影响植株大部分基因表达的因素主要是环境有关。Lee等[17]研究表明，植物对环境刺激相当敏感，简单的触碰和黑暗处理都有可能影响基因的表达变化。在本试验聚类结果中，K326开花当天所采三个品种（品系）样品的基因表达最相近，进一步说明基因的表达受环境影响关系很大，但不同品种（品系）中调控开花的关键基因仍通过差异表达决定开花。同时，通过试验的聚类结果可看到，K326花芽分化前19天所采样品的表达与华烟06花芽分化前19天所采样品的表达最相近，这说明无论早花还是晚花的烤烟，在感应到开花信息，达到开花准备的相同时期时，基因的调控机制相近。

前人研究结果表示，基因FPA能够抑制基因FLC的表达从而促进开花[18,19]。在本试验中，K326花芽分化过程中FPA的表达在未分化到分化过程中上调了10倍，而在花芽分化过后急剧下降，其对调控K326开花可能有较大影响。AGL20是调控开花的重要基因[20]，本试验中AGL20在K326花芽未分化到分化过程中上调了6倍；与K326相比，华烟06花芽分化过程中虽然AGL20也上调了10倍以上，但抑制开花的基因EMF2和COL9在此过程中也出现上调，这应该与华烟06较晚开花有关，同时说明植株开花是基因共同调控的结果。

研究表明CBF家族基因具有促进FLC表达的作用，导致植株晚花[21]。本试验中K326分化当天，华烟06和K326LF中CBF1的表达相对K326上调两倍以上，与K326相比，K326LF中促进开花的MADS-box家族基因AP1[13]的表达量低于K326；华烟06中AGL17和AGL20的表达相对K326LF下调，但其却早于K326LF出现花芽分化，这应该与华烟06中FPA相对K326LF上调有关。

前人研究表明，AGL20与AP2相互抑制调控开花，AGL20通过抑制CBFs的表达促进开花[22]。 本试验中K326和K326LF花芽分化过程中都检测出了AP2，但华烟06中未检测出，这应该与华烟06花芽分化过程中AGL20出现高于10倍的差异变化，从而抑制了AP2的表达有关（表2）。

安新民等研究表示，从毛白杨中获得的拟南芥开花相关基因AP3的同源基因PtAP3有可能在诱导植株早花中起到重要的作用[23]。Kelly 等人[24]从烟草中克隆了FLORICAULA(FLO)和LFY的同源基因NFL1和NFL2(Nicotiana FLO/LFY)，但试验证明它们与植株开花并无直接关系。艾育芳等[25]通过同源克隆法从油菜中得到LFY的同源基因BnLFY,试验表明其在油菜不同时期的根、茎、叶、蕾各器官都有表达，是组成型表达。通过前人的研究可以看出，性状的表现是基因相互作用的结果，具有相近的序列不一定功能相同。因此，基因芯片检测出的与开花可能存在主要关系的基因有可能只是与已知的开花基因具有同源性，其功能有待进一步研究。

4 结论

本研究通过分析各品种（品系）自身花芽分化过程基因表达差异的纵向比较及早花品种、抗早花品系间基因表达差异的横向比较，从中筛选了与开花相关的差异表达基因。在花芽分化过程中起主要作用的基因主要有AGL20、CCR2、ELF4、ERD7、CBF1、COR413-PM1、EMF2、VIP4、COL1、AGL17、COL9、FPA、SWN等。AGL20从K326花芽未分化到分化上调了6倍；从华烟06未分化1（距离其花芽分化的时间与K326花芽未分化到分化的间隔时间相同）到未分化2（K326花芽分化当天）上调了10倍以上，从未分化2到花芽分化又上调了3倍；从K326LF未分化到分化上调了2倍。花芽分化过程中，COL2、ELF4的表达差异达到了5倍；AGL62、CBF1、SWN、NAP与FPA的差异大于或等于10倍。

由于本试验所用烟草芯片中很多基因的功能都还未知，许多与开花相关的基因的研究仍需要通过合成引物，利用RT-PCR检测、测序、序列比对等技术进行进一步的探索，以明确烟草中存在的与早花相关的基因。本研究仅仅针对烤烟早花品种及其抗早花品系基因芯片的结果进行了分析研究，为烤烟开花相关的基因研究提供了初步的、最基础的分析预测。具体烤烟中该表达片段的序列及其在烤烟中的功能仍有待通过测序、克隆、转基因等进行更深入的研究以明确其在烤烟中的作用。

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A preliminary research on screening of premature fowering gene in fue-cured tobacco by microarray

YANG Jing1,2，CHEN Jie3，CHEN Jianjun2，DENG Shiyuan2，QIU Miaowen4，ZHAO Weicai4，WANG Wei2
1 Qiandongnan Zhenyuan County Tobacco Company,Zhenyuan 557700，Guizhou,China;
2 College of Agriculture,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;
3 Qiandongnan Tobacco Company,Kaili 556000,Guizhou,China;
4 Nanxiong Institute of Tobacco Science,Nanxiong 5124002,Guangdong,China

Agilent Tobacco Oligo Microarray was used to deduce expression profiling of flue-cured tobacco K326 and its premature flowering resistance variety Huayan06,K326LF during flower bud differentiation process.Genes related to flower bud differentiation were screened out: AGL20,CCR2,ELF4,ERD7,CBF1,COR413-PM1,EMF2,VIP4,COL1,AGL17,COL9,FPA andSWN,etc.Among them,COL2 and ELF4 had 5 times difference in terms of expression level while AGL62,CBF1,SWN,NAP had 10 times or above difference with FPA.The study provided a reference for further study of flue-cured tobacco premature flowering resistance mechanism and premature flowering resistance varieties breeding.

flue-cured tobacco;premature flowering;premature flowering resistance;gene chip;gene

杨静,陈杰,陈建军,等.利用基因芯片筛选烤烟早花基因初探[J].中国烟草学报，2015,21（3）

国家烟草专卖局重点科技项目“耐低温抗早花烤烟新品种选育及遗传生理机理研究”（110200902043）；广东省烟草专卖局(公司)科技项目“耐低温抗早花烤烟新品种选育”（200816）

杨静（1988—），硕士研究生，研究方向为烟草遗传育种， Email:yangjinggzchina@163.com

王维（1972—），博士，副教授，硕士生导师，主要从事烟草生理生化研究，Email: wangwei@scau.edu.cn

2014-08-29

: YANG Jing，CHEN Jie，CHEN Jianjun,et al.A preliminary research on screening of premature flowering gene in flue-cured tobacco by microarray [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)