植物源抗病毒剂VFB-1防治烟草花叶病毒病研究

陈丕庭，马树杰，殷培军,3，郑伟，马志卿，2，张兴，2

1西北农林科技大学无公害农药研究服务中心，陕西杨凌 712100；

2陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西杨凌 712100；

3黄岛出入境检验检疫局，山东青岛 266555

植物保护

植物源抗病毒剂VFB-1防治烟草花叶病毒病研究

陈丕庭1，马树杰1，殷培军1,3，郑伟1，马志卿1，2，张兴1，2

1西北农林科技大学无公害农药研究服务中心，陕西杨凌 712100；

2陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西杨凌 712100；

3黄岛出入境检验检疫局，山东青岛 266555

以植物源抗病毒剂VFB为基础，经配方改造和工艺改进，优化出了植物源抗病毒剂VFB-1。为探究VFB-1对烟草花叶病的防治作用，本研究采用半叶枯斑法测定了VFB-1对TMV的体外钝化、初侵染和复制增殖抑制活性；采用盆栽法和田间小区试验评价了VFB-1对烟草花叶病毒病的预防及治疗效果。结果表明，VFB-1对烟草花叶病毒(TMV)具有明显的体外钝化作用，钝化30min后，抑制率达82.77%；对TMV的初侵染和复制增殖具有较好的抑制作用，24 h的抑制率分别达到69.80%和54.07%｡盆栽药效试验中，VFB-1100倍稀释液的预防效果为70.23%，治疗效果为35.70%；田间药效试验表明，VFB-1对烟草花叶病毒病有较好的预防和治疗作用，其200倍稀释液药后21d的预防效果仍为40%以上，400倍液的预防效果明显高于VFB，且与病毒A（20% 吗啉胍·乙铜WP）相当；其200倍液14d的治疗效果显著高于VFB（200倍稀释液）和病毒A（400倍稀释液）处理。可见，植物源抗病毒剂VFB-1对TMV具有良好的预防和治疗效果，开发前景良好｡

VFB-1；烟草花叶病毒；抗病毒活性；烟草花叶病；植物源农药

植物病毒病在农业生产中发生普遍、危害严重，且难以防治[1]。据统计，我国大多数烟区烟草花叶病流行年份田间发病率高达50%以上，严重者绝收[2-3]。由于植物病毒对寄主细胞具有绝对寄生性，病毒传播方式具有多样性，且植物缺乏完整的免疫系统，因而高效抗病毒剂的开发存在极大困难，至今尚未有理想的化学防治药剂[4]。大量研究表明，植物源农药具有安全、作用方式多样、与环境相容等优点，因此加强植物源抗病毒剂的研究成为新农药开发及植物病毒病防治的重要工作[5-7]。目前已发现多种植物提取液具有良好的抗TMV活性[8-12]。

VFB是由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心研制的一种植物源抗病毒剂，前期试验表明其对烟草、辣椒等多种作物上的多种植物病毒病均具有良好的预防作用，但治疗效果一般[13-17]。李晨等已经对VFB的配方及加工工艺进一步改进，药效有明显提高，但成本仍然偏高，工艺较为复杂[18]。在此基础上，经进一步的配方和工艺优化，研制出了VFB-1，初步的室内试验表明，该配方抗病毒活性优于VFB，但田间效果尚不明确。基于此，本研究以TMV为供试毒源，采用半叶法、盆栽法及田间小区试验，较为系统地评价VFB-1对TMV的抑制作用，以期为该药剂的进一步应用提供依据和奠定基础｡

1 材料与方法

试验于2012年6月至2013年10月在西北农林科技大学无公害农药研究服务中心和河南省渑池县果园乡李家村中烟种植基地完成。

1.1 材料

寄主：以心叶烟 (Nicotiana glutinosa L.)为枯斑寄主，以普通烟(Nicotiana tabacum) K326为系统寄主。将烟草种子与一定量基质混匀后均匀洒在装有基质的育苗盘，浇水适量，于适宜条件下(温度22±1℃，光照16h/d，湿度60%)培养，当幼苗长至4～6片真叶时供试｡

供试毒源：TMV由西北农林科技大学植物保护学院病毒研究室提供，保存于普通烟(N.tabacum)上，参照Gooding等的方法进行提纯[19]。TMV接种液由新鲜病叶和 PBS缓冲液 (0.01 mol·L-1，pH 7.2)按1﹕2(W/V)的比例研磨后，用4层纱布过滤待用｡

供试药剂：VFB-1和VFB水剂由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供；20%病毒A可湿性粉剂（20% 吗啉胍·乙铜WP），由惠州市中迅化工有限公司生产。

1.2 室内生测试验方法

室内生测均采用半叶枯斑法[20]，在22±1℃室温下进行，以健康、生长旺盛的5～6叶期心叶烟供试。

1.2.1 体外钝化作用

钝化试验中，左半叶接种供试药剂与病毒等体积混合液，右半叶接种蒸馏水与病毒等体积混合液(对照)。VFB-1、VFB和病毒A均稀释50倍，钝化时间分别为0.5、1和2 h，共9个处理。每处理接种6片叶子，重复3次，3 d后统计枯斑数，计算抑制率。枯斑抑制率按照“1.5”中公式计算。

1.2.2 抑制TMV初侵染和增殖作用

VFB-1和VFB的供试浓度分别为50、100和200倍稀释液，而以病毒A400倍稀释液为对照。初侵染试验中，各处理分别在施药24h后接种病毒；增殖试验中，均在接种病毒后施药。施药方式为涂抹法，左半叶涂抹供试药剂，右半叶为清水对照。每处理接种6片叶子，重复3次，3 d后统计枯斑数，计算抑制率。枯斑抑制率按照“1.5”中公式计算。

1.3 盆栽试验方法

选择 5-6 叶期，长势一致、健壮的普通烟供试。试验设预防组（第3次施药 24 h后接种 TMV）、治疗组（接种 TMV 24 h后施药 3 次）和对照组（只接种不施药）。分别用 VFB-1和VFB 100 倍液及病毒A 400倍液喷雾处理，每 5 d 施药一次，共施药三次。TMV接种浓度为 1：20(W/V)。施药结束后 7d 检查发病情况，统计病情指数及防治效果。每处理 60 株烟苗，试验重复 3 次。

1.4 田间药效试验方法

田间小区药效试验地位于河南省渑池县果园乡李家村连续3年种植烟草、病毒病常年发生严重的田块进行，烟草品种为中烟100，烟田肥力较为均匀，烟苗5月3日移栽，生长健壮，长势均匀，自然发病。试验分为预防试验和治疗试验。预防试验在烟苗移栽后尚未发病时进行，设VFB-1和VFB的 100倍液、200倍液和400倍液3个剂量，常量喷雾处理，以20%的病毒A可湿性粉剂400倍液为对照，并设清水对照，共7个处理，每处理重复3次，每隔7d施药1次， 3次施药7d后 (7月16日)调查病情，共调查3次。治疗试验在烟苗发病初期时进行，设VFB-1和VFB的 100倍液、200倍液2个剂量处理，以20%的病毒A可湿性粉剂400倍液为对照，并设清水对照，共5个处理，每处理重复3次，施药前调查病情指数，施药后7天(7月16日)调查病情，每隔7d施药1次，共2次。小区面积为20m2，采用随机排列，处理间设立保护行。

田间调查病情分级标准为：0级，全株无病；1级，心叶明脉或轻微花叶，病株无明显矮化；3级，1/3叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上；5级，1/3-1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高2/3-3/4；7级，1/2-2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2-2/3；9级，全株叶片花叶，严重变形或坏死，或株矮化为正常株高的1/2以上。

1.5 结果计算及统计方法

室内生测试验中，统计处理和对照的枯斑数，计算枯斑抑制率：

枯斑抑制率(%)=(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数×100

田间试验中，调查各处理的病情，计算病情指数及防效：

病情指数=∑(病级数×病株数)/(最高病级×处理总株数)×100

预防效果=(对照病指—处理病指)/对照病指×100%

治疗效果=[1-(对照区药前病指×处理区药后病指)/(对照区药后病指×处理区药前病指)]×100%

采用SPSS13.0统计软件进行数据分析处理，用单因素方差分析统计各处理平均数的差异，LSD法比较各处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 VFB-1对TMV体外钝化作用

采用半叶枯斑法测定了VFB-1在心叶烟上对TMV的钝化作用。结果（表1）表明，VFB-1对TMV病毒粒子具有强烈的体外钝化活性，且随钝化时间的延长，钝化效果逐渐增强，50倍稀释液钝化5、30和60min后，抑制率分别为79.78%、82.77%和83.40%，均显著高于相同钝化时间下对照药剂病毒A和VFB。

表1 VFB-1对TMV的体外钝化作用Tab.1 Inactivation of VFB-1 to TMV in N.glutinosa at different treating times in vitro

2.2 VFB-1对TMV初侵染的抑制作用

采用半叶枯斑法测定了VFB-1对TMV初侵染的抑制作用，结果见表2。由表2可看出,VFB-1对TMV初侵染表现出明显的抑制作用，施药24h后接种，在50、100和200倍稀释液处理后，对TMV的抑制率分别达到了69.80%、62.70%和57.85%；随着VFB-1稀释倍数增加，其对TMV初侵染的抑制率有所降低，但抑制率显著高于同等稀释倍数的VFB和对照药剂病毒A400倍液处理。

表2 VFB-1对TMV初侵染的抑制作用Tab.2 Inhibiting infectivity of TMV in N.glutinosa by VFB-1

2.3 VFB-1对TMV复制增殖的抑制作用

采用半叶枯斑法测定了VFB-1对TMV增殖的抑制作用，结果见表3。从表3可以看出，VFB-1对TMV的复制增殖具有较好的抑制作用。接种24h后施药，在50、100和200倍剂量下，对TMV的抑制率分别为54.07%、49.21%和45.29%，随着稀释倍数逐渐增大，对TMV的抑制率逐渐降低，但抑制率显著高于同等稀释倍数的VFB和对照药剂病毒A 400倍液处理。

表3 VFB-1对TMV复制增殖的抑制作用Tab.3 Inhibiting multiplication of TMV in N.glutinosa by VFB-1

2.4 VFB-1对烟草花叶病毒病的盆栽药效试验

用 VFB-1100 倍液和VFB100倍液喷雾处理普通烟，测定其对烟草花叶病毒病的预防和治疗效果。由试验结果（表4）可以看出，VFB-1对TMV的侵染表现出较好的预防作用，防效达到70.23%，显著高于VFB和对照药剂病毒A；在治疗试验中，药效相对一般，防效仅为35.70%，但显著高于VFB和对照药剂病毒A处理。

表4 VFB-1 防治烟草花叶病毒病的盆栽试验结果Tab.4 Effect of VFB-1 against tobacco mosaic disease in pot e xperiment

2.5 VFB-1防治烟草病毒病的田间药效试验结果

2.5.1 预防作用

由表5可以看出，VFB-1各浓度处理对烟草病毒病均具有良好的预防作用，其100倍液对烟草病毒病的效果最好，药后7d、14d和21d的防效分别达56.03%、55.17%和50.23%，显著高于对照药剂病毒A；另外，随着VFB-1稀释倍数的增加，VFB-1对烟草病毒病的预防作用有所降低，稀释至400倍时，其防效高于同期病毒A处理（400倍稀释液）和VFB 400倍液处理。

表5 VFB-1对烟草病毒病的保护作用Tab.5 Protection effect of VFB-1 against tobacco mosaic disease in field trial（Sanmenxia,Henan province,from June to August 2013）

2.5.2 治疗作用

VFB-1对烟草病毒病的治疗作用测定结果见表6。由表6可以看出，VFB-1对烟草病毒病表现出较好的治疗效果。其中VFB-1100倍液在施药后7d和14d的治疗效果分别达到了41.68%和59.47%；VFB-1200倍液药后14d的治疗效果仍达49.20%，显著高于同剂量的VFB处理及病毒A 400倍液处理。

表6 VFB-1对烟草病毒病的治疗作用Tab.6 Remedial effect of VFB-1against tobacco mosaic disease i n field trial (Sanmenxia,Henan province,from June to August 20 13）

3 讨论

3.1 VFB-1对烟草花叶病毒病有较好防效

近年来，生物源抗病毒剂的研发已成为抗病毒剂开发中的主流，也有部分产品获得成功，例如壳寡糖、香菇多糖、宁南霉素等。本研究以植物源抗病毒剂VFB的升级改造产品VFB-1为材料，较为系统地测定了其室内外药效。室内生测表明，VFB-1较VFB的抗TMV的活性更强；田间药效试验显示，VFB-1不但对烟草病毒病具有较好的预防作用，且具有明显的治疗效果，其100倍液施药7d和14d后的药效分别达到了41.68%和59.47%，显著优于VFB原配方和病毒A。据报道，常见生物源抗病毒剂中，8% 宁南霉素1000倍液对烟草病毒病的田间预防作用约为55%，病毒丰500倍液对烟草病毒病的田间预防作用约为40%， 氨基寡糖素500倍液对烟草病毒病的田间预防作用约为35%[21-26]，而这几种药剂对烟草病毒病的治疗效果均不理想。可见，VFB-1对烟草病毒病的田间预防作用要略高于病毒丰和氨基寡糖素，而弱于宁南霉素，但治疗作用明显好于这三种常见制剂。

另外，VFB-1制剂是以植物材料加工研制而成，包括马齿苋、甘草等，其剂型也为水剂，不含任何有机溶剂，因此，该药剂对环境、人畜应十分安全。

综上所述，VFB具有抗病毒活性高，药效优良，无公害，加工材料成本低，资源丰富，加工工艺简单等优点，符合现代农药发展方向，具有良好的开发应用潜力。

3.2 VFB-1制剂的田间应用技术需要进一步研究

科学的用药技术包括施药时间、施药方式、施药剂量、施药次数等。本研究中，对VFB-1主要采用常量喷雾法施药，取得了较好的防治效果，而在以往VFB的试验中还采用灌根及灌根加喷雾等处理方法[18]。因此，对VFB-1的施药方式还需要进一步研究。本试验施药时间主要在烟苗旺长期和成熟期，而没有进行返苗期和伸根期的药剂处理，在返苗期和伸根期施药是否对烟草病毒病的预防效果更好，尚需进一步探讨。此外，本试验主要测定了VFB-1对烟草花叶病毒病的预防和治疗效果，前期试验表明VFB对烟草、辣椒等多种作物上的多种植物病毒病均具有良好的防效[17]，因此，还有必要开展VFB-1防治谱的研究。

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Control effect of phytogenic VFB-Ⅰagainst tobacco mosaic virus disease

CHEN Piting1，ZHENG Wei1，MA Shujie1,2，MA Zhiqing1,2，ZHANG Xing1,2
1 Research &Development Center of Biorational Pesticides,Shaanxi Research Center of Biopesticide Engineering &Technology,Yangling,Shaanxi 712100,China；
2 Key Laboratory of Plant Protection Resources and Pest Management,Ministry of Education Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling,Shaanxi 712100,China

Effect of VFB-I on tobacco mosaic virus (TMV) was evaluated with anti-TMV activities tested in vitro by local lesion.Protection and treatment efficiencies of VFB-I on TMV were evaluated by pot experiment and field plot trials.Results showed that VFB displayed significant inactivation on TMV with inhibition rate of 82.75% after mixing VFB with TMV for 0.5 h.Infection and replication of TMV to Nicotiana glutinosa were also inhibited by VFB-I,with inhibition rate of 69.80% and 54.06%,respectively.Pot experiment showed that protection efficiency of VFB-Ⅰagainst TMV disease was 70.24% and remedial efficiency was 35.71% by spraying with VFB-Ⅰ diluent of 1:100.In field trials,protection efficiency of VFB-Ⅰdiluent of 1:400 on TMV disease was higher than that of VFB,but equivalent to that of 20% moroxydine+cupric acetate WP at the same concentration.The remedial effect of VFB-Ⅰ(diluent of 1:200)was much stronger than that of 20% moroxydine+cupric acetate WP (diluents of 1:400) and VFB (diluents of 1:200).VFB-Ⅰ showed higher anti-TMV activity indicating that it is effective in controlling TMV disease.

VFB-Ⅰ；TMV； anti-virus activity； tobacco mosaic disease；botanical pesticide

陈丕庭，马树杰，殷培军，等。植物源抗病毒剂VFB-1防治烟草花叶病毒病研究[J].中国烟草学报，2015,21（3）

国家公益性行业（农业）科研专项（200903052）

陈丕庭（1987—），硕士研究生，主要研究方向为农药学，Email：peiting365@163.com

马志卿（1975—），博士，教授，主要研究方向为生物农药研发及农药毒理学，Email: mazhiqing2000@126.com

2014-03-07

: CHEN Piting，ZHENG Wei，MA Shujie,et al.Control effect of phytogenic VFB-Ⅰ against tobacco mosaic virus disease [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)