干扰素诱导蛋白p204过表达抑制大鼠主动脉血管外膜成纤维细胞凋亡、增殖与迁移

宋方，田茂波，肖燕，龙向淑，吴强

干扰素诱导蛋白p204过表达抑制大鼠主动脉血管外膜成纤维细胞凋亡、增殖与迁移

宋方，田茂波*，肖燕，龙向淑，吴强

目的：观察干扰素诱导蛋白p204过表达对大鼠主动脉血管外膜成纤维细胞（VAFs）凋亡、增殖与迁移的影响。

方法：分别应用携带p204基因（Ifi204）的慢病毒颗粒（Ifi204-Lv组）、空载慢病毒颗粒（Con-Lv组）感染VAFs，未经处理的VAFs作为阴性对照组。用噻唑蓝（MTT）比色法检测VAFs增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，细胞划痕法和Transwell法测定细胞迁移情况，应用实时定量逆转录-聚合酶链反应（realtime q RT-PCR） 和蛋白免疫印迹（Western blotting）分别检测p204、抑癌因子p53及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21WAF（p21）的mRNA和蛋白表达。

结果： Ifi204-Lv组与Con-Lv组、阴性对照组相比较，细胞增殖降低［（吸光度值），48 h：0.53 ±0.05 vs 0.66±0.03、0.63 ±0.06；72 h: 0.89±0.06 vs 1.02±0.06、1.01±0.07］及迁移距离缩短［（像素），61.00±1.83 vs 74.50±6.25、75.50±7.85］、数量降低（61.75±10.69 vs 155.25±10.21、153.75±9.40），差异均有统计学意义（P均＜0.05），但组间比较细胞凋亡率差异无统计学意义。 与Con-Lv组、阴性对照组相比，Ifi204-Lv组的p204（3.45±0.15 vs 2.09±0.10、2.06±0.09）、p53（3.41±0.09 vs 2.06±0.07、2.10±0.06）及p21（3.01±0.08 vs 2.05±0.06、2.11 ±0.08）的mRNA和蛋白表达均上调，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

结论： p204过表达可抑制大鼠VAFs增殖与迁移，其机制可能部分与激活p53及p21表达有关。

干扰素诱导蛋白； p204；血管外膜成纤维细胞；凋亡；增殖；迁移

Methods: Our research included in 3 groups: If204-Lv group, in whichVAFs were infected by If204-recombined lentivirus, Con-Lv group, in which VAFs carried the empty vector without virus, Blank control group, in which VAFs were untreated. VAFs proliferation was examined by MTT method, cell apoptosis was measured by fow cytometry and the migration was detected by scratching assay and transwell chamber method. The mRNA and protein expressions of p204, p53 and p21were evaluated by real-time q RT-PCR and Western blot analysis respectively.

Results: Compared with Con-Lv and Blank control groups, If204-Lv group had decreased VAFs proliferation (by OD value) at 48 hours: (0.53 ± 0.05) vs (0.66±0.03) and (0.63 ± 0.06), at 72 hours: (0.89 ± 0.06) vs (1.02 ± 0.06) and (1.01 ± 0.07); distance of cell migration (by pixel): (61.00 ± 1.83) vs (74.50 ± 6.25) and (75.50 ± 7.85); number of cell migration: (61.75 ± 10.69) vs (155.25 ± 10.21) and (153.75 ± 9.40), all P＜0.05. VAFs apoptosis rates were similar among different groups. Compared with Con-Lv and Blank control groups, Ifi204-Lv group presented up-regulated mRNA

expressions of p204 (3.45 ± 0.15) vs (2.09 ± 0.10) and (2.06 ± 0.09); p53 (3.41 ± 0.09) vs (2.06 ± 0.07) and (2.10 ± 0.06); p21 (3.01 ± 0.08) vs (2.05 ± 0.06) and (2.11 ± 0.08), all P＜0.05.

Conclusion: p204 over-expression inhibits VAFs proliferation and migration which might be partly related to the activation of p53 and p21 expression in experimental rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1110.)

血管外膜成纤维细胞（VAFs）与动脉粥样硬化、高血压、血管介入治疗及冠状动脉旁路移植术后再狭窄等血管增殖性疾病的发生、发展密切相关[1-3]。鼠p204属干扰素诱导蛋白200家族（ p200）成员，其能通过多种机制发挥抗增殖作用[4]。前期研究发现p204在大鼠主动脉血管外膜存在丰富的表达[5]，干扰素-α （IFN-α）可诱导VAFs中p204表达增加，同时抑制VAFs的增殖[6]，提示IFN-α抑制VAFs增殖的作用可能部分与p204表达有关。因单纯p204过表达对VAFs增殖、迁移等生物学功能的影响尚少见报道，本研究进一步通过慢病毒介导p204过表达，观察其对VAFs凋亡、增殖与迁移的影响，探讨其可能的机制，为治疗血管狭窄性疾病提供新的理论依据。

1 材料与方法

材料：本实验起止时间为2014-05至2015-01。清洁级SD大鼠购自贵州医科大学实验动物中心；DMEM高糖型细胞培养液、胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司；含p204基因（Ifi204，GenBank ID: BC010546）全长ORF的慢病毒颗粒（载体为pReceiver-Lv201）由广州复能基因有限公司合成；聚合酶链反应（PCR）扩增引物由上海生工合成（表1）；FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（KR106）购自北京天根公司；iTaqTMUniversal SYBR®Green Supermix（#172-5120）购自美国Bio-Rad公司；p204抗体（sc-13367）购自美国Santa Cruz公司；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21WAF（p21）抗体（ab92675）购自英国Abcam上海分公司；抑癌因子p53抗体购自美国GeneTex公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）内参抗体购自上海碧云天；噻唑蓝（MTT）细胞增殖、细胞毒性检测试剂盒（C0009）及Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（C1062）购自上海碧云天公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

表1 聚合酶链反应引物序列

大鼠VAFs的培养和分组：大鼠主动脉VAFs的培养、纯化及鉴定按文献[6]报道的方法，取4～6代细胞用于实验。实验细胞分为3组，即携带Ifi204基因的重组慢病毒颗粒感染组（Ifi204-Lv组）、空载慢病毒颗粒感染对照组（Con-Lv组），未经处理的VAFs作为阴性对照组。

慢病毒感染：取对数生长期细胞接种于六孔板中，用10% FBS的DMEM高糖培养液培养，待细胞汇合度达50%左右，按慢病毒转染说明书操作，以含Ifi204基因的慢病毒颗粒（Ifi204-Lv）和对照的空载慢病毒颗粒（Con-Lv）分别感染VAFs，孵育过夜后更换为正常培养液，分别于48 h后收集细胞用于提取总RNA，于72 h后收集细胞用于提取总蛋白。每组每时间点3～6复孔，实验重复3次。

实时定量逆转录-聚合酶链反应（real-time qRT-PCR）检测mRNA表达：按TRNzol总RNA提取试剂盒说明操作提取VAFs总RNA，取1 μg按FastQuantcDNA第一链合成试剂盒说明逆转录合成cDNA。取2 μl产物进行PCR循环，按Bio-Rad公司iTaqTMUniversal SYBR®Green Supermix试剂盒说明配制20 μl PCR反应体系，PCR反应条件为：起始模板预变性（95℃, 10min），PCR循环模板变性（95℃ 15 s）+延长（60℃, 1min）循环40次，溶解曲线65℃到95℃、每5 s增加0.5℃。以GAPDH为内参照，2-ΔΔCt法计算各组p204、p53及p21 mRNA的相对表达量。

蛋白免疫印迹（Western blotting）检测蛋白表达：提取VAFs总蛋白，每孔上样80 μg蛋白样品进行

SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转膜转移蛋白条带至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。将膜置Western封闭液中室温下封闭1 h；加入p204一抗工作液，室温下孵育15 min后置4℃冰箱过夜；TBST缓冲液（pH=7.4）洗膜，室温下孵育稀释的二抗1 h；TBST洗膜，电化学发光（ECL），显影定影。蛋白膜应用Western一抗二抗去除液处理后，同法封闭、孵育p21、p53及GAPDH内参一抗及二抗。胶片扫描，Image J软件分析p204与内参条带的吸光度值之比。

噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞活力：收集对数生长期细胞，按约4000个细胞/孔接种于96孔板，细胞孵育过夜后，每组分别设6个复孔，设置调零孔2个，各组干预方法同前，继续培养48 h及72 h后收集细胞。按文献[6]的方法在Bio-tek Elx800UV型酶标仪测A490nm处吸光度值。

流式细胞术检测细胞凋亡和坏死：按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（C1062）说明书操作收集、重悬及染色细胞后进行流式细胞仪检测。

细胞划痕法观察细胞迁移距离：按文献[7]的方法通过细胞划痕法观察细胞迁移距离。在6孔板背后均匀画出6条横穿过孔的线条（每孔2条），待孔内各组细胞汇合度达90 %后，用划线工具垂直于孔背面横线划痕。吸弃孔内液体，并用PBS缓冲液（pH=7.4）清洗2遍，加入低血清培养液。显微镜下拍照后，放入细胞培养箱培养24 h后取样、拍照、计算迁移距离。迁移距离=划痕0 h后划痕宽度－划痕24 h后划痕宽度，以像素（pixel）作为长度单位，每组4复孔细胞。

Transwell小室定量迁移细胞：按文献[7]的方法通过Transwell小室计算迁移细胞数量。取各组对数生长期细胞，用无血清DMEM培养液重悬细胞至1×106个/L。每个小室（上室）中加入100 μl上述细胞悬液，在24孔板内（下室）加入含5 % FBS的DMEM培养液600 μl，培养8 h后吸弃孔内培养液，上室用PBS液洗涤3遍后，将小室置于4 %多聚甲醛中固定20 min，自然晾干后再将小室置于0.1 %结晶紫中染色20 min，之后用PBS液洗涤5遍。晾干后，每组4复孔细胞，每孔细胞在显微镜下随机选取4个视野，观察细胞并计数。

2 结果

2.1 干扰素诱导蛋白p204过表达对VAFs增殖、凋亡及迁移的影响

干预后各组细胞继续培养48 h和72 h，表2可见，与Con-Lv组、阴性对照组比较，Ifi204-Lv组的MTT吸光度值均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞仪结果提示，与Con-Lv组、阴性对照组比较，Ifi204-Lv组的凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05，表2、图1）。

表2 干扰素诱导蛋白p204过表达对血管外膜成纤维细胞增殖、凋亡及迁移的影响

表2 干扰素诱导蛋白p204过表达对血管外膜成纤维细胞增殖、凋亡及迁移的影响

注：Ifi204-Lv组：携带Ifi204基因的重组慢病毒颗粒感染组；Con-Lv组：空载慢病毒颗粒感染对照组；MTT A490OD值：噻唑蓝比色法测定490 nm波长的吸光度值。与阴性对照组比较*P＜0.05；与Con-Lv组比较ΔP＜0.05

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图1 p204过表达对血管外膜成纤维细胞凋亡的影响

细胞划痕24 h后计算迁移距离，与Con-Lv组、阴性对照组比较，Ifi204-Lv组的迁移距离缩短（P＜0.05）；通过Transwell小室计算迁移细胞，与Con-Lv组及阴性对照组比较，Ifi204-Lv组的迁移细胞数量减少（P＜0.05，见图2及表2），差异均有统计学意义。以上各指标在Con-Lv组和阴性对照组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 干扰素诱导蛋白p204过表达对血管外膜成纤维细胞迁移距离和数量的影响

2.2 干扰素诱导蛋白p204基因过表达后对VAFs中p53及p21mRNA与蛋白表达的变化

real-time qRT-PCR结果（表3）：与Con-Lv组、阴性对照组比较，Ifi204-Lv组Ifi204、p53及p21的mRNA表达量均增加，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

表3 实时定量逆转录-聚合酶链反应分析Ifi204过表达对3组血管外膜成纤维细胞中p53及p21mRNA表达的影响

表3 实时定量逆转录-聚合酶链反应分析Ifi204过表达对3组血管外膜成纤维细胞中p53及p21mRNA表达的影响

注：与阴性对照组比较*P＜0.05 ；与 Con-Lv组比较ΔP＜0.05。余注见表2

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Western blotting 结果（图3）：与Con-Lv组、阴性对照组比较，Ifi204-Lv组p204蛋白表达上调（P＜0.05），伴随着p53及p21蛋白表达增加，差异均有统计学意义（P＜0.05，）。p204、p53及p21的mRNA与蛋白表达在阴性对照组和Con-Lv组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 蛋白免疫印迹分析p204过表达对血管外膜成纤维细胞中p53及p21蛋白表达的影响

3 讨论

血管重构是血管增殖性疾病的主要病理生理机制。既往认为在血管重构过程中，血管平滑肌细胞作为动脉血管的主要成分细胞起着主要作用，而VAFs作为“旁观者”，仅起着支持与营养的作用。但近年来，越来越多的研究证明VAFs的增殖、迁移与分泌细胞外基质等在血管重构过程中起着重要的作用[1，2]。将VAFs作为治疗靶点，有效地抑制其增殖、迁移对防治血管增殖性疾病有重要意义。

研究已证实p204通过与多种细胞因子或转录因子结合并反应，广泛参与调节细胞增殖和分化、衰老和凋亡，在自身免疫反应、抗病毒及抗癌等领域发挥着重要的作用[4,8]。p204过表达具有抑制细胞生长的功能，可以延缓细胞周期G1/S及G2/ M转换[9,10]。p204蛋白的200 X结构中含有MF/ LHATVAT/S模序，该模序介导和53BP1（p53结合蛋白1）的结合从而激活p53来抑制肿瘤细胞增殖与迁移[9,11]。本研究通过慢病毒介导p204过表达，结果抑制了VAFs增殖与迁移，同时p53及p21表达上调，提示p204能促进p53及p21表达并发挥其抗增殖及迁移作用，其机制可能部分是通过p204蛋白中的MF/LHATVAT/S氨基酸模序，介导和53BP1的结合从而激活p53来实现的。激活p53及高水平的p21表达，可引起细胞凋亡[12]，p204亦参与p53介导的细胞凋亡[4,13]，我们在VAFs过表达p204并未增加细胞凋亡，可能与p204表达未达该实验细胞的凋亡效应剂量有关，若能进一步上调p204的表达或其下游信号通路蛋白如p53或p21的表达，可能观察到更明显的细胞生长抑制效应甚至增加凋亡。

p21通过抑制细胞周期蛋白/细胞周期依赖性激酶（cyclin/CDK）复合物活性，使细胞周期进程受阻，抑制细胞生长[14]。其启动子上有p53的结合位点，p53是重要的抑瘤因子，p53在转录水平使p21表达增加[12]。本研究通过慢病毒介导p204过表达，结果p53及p21转录及蛋白表达增加，提示p204通过促进p53的表达来提高p21的表达，发挥后者抑制细胞生长的作用。p21的表达除受p53转录调节外，也存在非p53依赖信号通路，p204是否直接参与调控p21尚少见报道。

本研究通过慢病毒介导p204过表达来观察其对VAFs增殖、凋亡与迁移的影响及机制。结果显示，p204过表达可抑制大鼠VAFs增殖与迁移，其机制可能部分与激活p53及p21表达有关。

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Interferon-induced Protein 204 Over-expression Inhibits Aortic Vascular Adventitial Fibroblast Proliferation and Migration in Experimental Rats

SONG Fang, TIAN Mao-bo, XIAO Yan, LONG Xiang-shu, WU Qiang.
Department of Cardiology, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang (550002), Guizhou, China

Objective: To observe the effects of interferon-induced protein 204 (p204) over-expression on apoptosis, proliferation and migration of aortic vascular adventitial fbroblast (VAFs) in experimental rats.

Interferon-induced protein, p 204; Vascular adventitial fbroblast; Apoptosis; Proliferation; Migration

2015-03-16）

（编辑：梅 平）

国家自然科学基金资助项目(No. 81260030)；贵州省科技攻关项目(黔科合LH字[2014]7023号)

550002 贵州省贵阳市，贵州省人民医院 心内科

宋方 主治医师 博士研究生 主要研究方向为心肌及心血管重构的基础与临床 Email：songfangheart@126.com 通讯作者：吴强

Email：gzgywq@126.com*并列第一作者

R541

A

1000-3614（2015）11-1110-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.11.018