高压腌制对鸡胸肉微观结构的影响

冷雪娇，邓绍林，章 林，黄 明,*，周光宏

（1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

高压腌制对鸡胸肉微观结构的影响

冷雪娇1,2，邓绍林2，章 林2，黄 明2,*，周光宏2

（1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

采用食盐质量浓度为40 g/L的腌制液，在不同压力条件下（0.1、50、100、150、200、300 MPa，保压时间20 min）腌制鸡胸肉，应用低场核磁共振、明场相差显微镜和透射电镜研究鸡胸肉在不同压力条件下微观结构的变化。结果表明：高压腌制处理对鸡胸肉的水分存在状态具有显著的影响（P＜0.05），300 MPa时的T22向慢弛豫方向移动，150 MPa时的不易流动水占总水分的百分含量最高。150 MPa以下处理组的肌肉组织结构无显著差异，肌细胞形状规则，排列有序；200 MPa处理下鸡胸肉的肌纤维排列疏松，肌纤维之间肌束膜开始破裂；300 MPa处理下鸡胸肉的肌束膜发生大量断裂和崩解，鸡胸肉的肌原纤维结构也发生明显变化，Z线和I带被彻底破坏，在Z线和M线附近形成了重聚体，肌纤维丝发生消融。150 MPa处理组的鸡胸肉肌肉结构保持良好。

高压；腌制；鸡胸肉；微观结构

腌制是指用食盐或以食盐为主，并添加硝酸钠（或钾）、亚硝酸钠、蔗糖和香辛料等腌制辅料处理肉类的过程，是肉制品加工过程中一个重要的环节[1]。常用的腌制方法基本可分为干腌、湿腌、盐水注射及混合腌制法四种，但基本都存在腌制周期较长，腌制效率低等问题。超高压作为近年来新兴的一门技术能够有效缩短肉制品的腌制周期，提高腌制效率[2-4]，并且还能够抑制微生物生长[5]、保持肉品原有的天然色、香、味和营养成分[6-10]，从而使得高压处理的腌制技术成为新的研究热点。

目前关于高压的研究大多集中在采用相对较高的压力，比如400、600 MPa的高压进行杀菌和嫩化，然而过高的压力会导致肉的颜色发白，脂肪发生氧化[11]等问题，从而使得肉品品质下降。但是，在较低压力下进行腌制对鸡胸肉的食用品质影响较小，并且，有研究表明高压能有效提高鸡胸肉的腌制速率，150 MPa腌制处理时食盐的扩散速率最大，另外，高压腌制还能改善鸡胸肉的嫩度，增强保水性[3,12]。

此外，高压处理可能会对肌肉的微观结构产生一定的影响。肌肉的微观结构能够反映出肌肉的品质，例如肌纤维直径的变化能反映肌纤维特性的变化情况、肌纤维的组织学特性与肌肉品质特性，特别是和食用品质密切相关。肌纤维越细，肌纤维密度越大，保水性越大，肉质越细嫩；肌纤维直径越大，肌纤维密度越小，保水性越小，肉质越老[13]。本实验从微观角度出发，用低场核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）、明场相差显微镜和透射电镜（transmission electron microscope，TEM）等技术，研究鸡胸肉在不同压力条件下微观结构的变化，以期为高压条件下腌制鸡胸肉食用品质的变化提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

24 只三黄鸡购于南京市童卫路农贸市场，每只质量约1.5 kg，宰杀取其胸肉，置于4 ℃冷库成熟24 h后使用。

1.2 仪器与设备

UHPF/2L/800MPa型食品高压设备 包头科发高新技术食品机械有限公司；H-600型透射电子显微镜 日本Hitachi公司；SX-40型光学显微镜 日本Akashi公司；1850型冷冻切片机 德国Leica公司；PQ001台式NMR分析仪 上海纽迈电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高压处理方法

将成熟24 h后的鸡胸肉置于真空包装袋中，以料液比（m/V）为1∶3加添食盐质量浓度为40 g/L的腌制液，排除气泡后用封口机封口，最后置于高压设备中进行处理。在压力分别为50、100、150、200、250、300 MPa条件下腌制20 min，以常压（0.1 MPa）腌制20 min作为对照。研究表明常温条件下压力每升高100 MPa温度升高3 ℃[14]，为控制高压腌制时温度保持在（25±1）℃，在高压处理前将传压介质（蒸馏水）初始温度降至16～24 ℃，如表1所示[3]。腌制结束时取出鸡胸肉，用吸水纸擦干肉表面水分，用核磁共振、明场相差显微镜和透射电镜研究鸡胸肉在不同压力处理条件下微观结构的变化。

表1 高压腌制时温度的控制描述[3]Table 1 Description of temperature control during high pressure brining[3]

1.3.2 不同压力腌制鸡胸肉的NMR水分存在状态测定

取2 g体积约为1 cm×1 cm×2 cm的鸡胸肉（来自4 只不同的鸡）4 份，分别放入检测管中进行低场核磁共振检测，最后取4 次检测结果的平均值作为鲜鸡胸肉的每个时间点的弛豫特征值。

将样品管放入样品池中，打开核磁共振分析软件进入硬脉冲序列。利用CPMG脉冲序列测量样品的自旋-自旋弛豫时间（T2）。将样品分别置于磁场中心位置的射频线圈的中心，利用FID信号调节共振中心频率，然后进行CPMG脉冲序列扫描实验。参数设置为：PulSeqType=2，SF1=22 MHz， O1=482.173 096 kHz，SW=100 kHz，Ds=120，RG1=30，RG2=3，TR=4 000 ms，I=150，EchoCount=500，NS=2。采样结束后进行T2拟合保存实验结果，然后进入T2反演软件反演出实验结果。

1.3.3 光学显微镜观察不同压力腌制的鸡胸肉

从每个肉样上顺肌纤维方向取0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm肉样，样品放入液氮中冻结12 h，沿肌纤维垂直方向冰冻切片，切片厚度为10 μm。固定于经过APES包被的载玻片上，晾片5 min。切片染色步骤：苏木素染液浸染3 min，70%和80%乙醇梯度脱水，然后用85%乙醇配制的酸化的伊红溶液染色30 s，80%、90%和100%梯度乙醇脱水，二甲苯通透，中性树胶封片。制备好的玻片在显微镜下进行观察。

用Image-pro plus 软件（5.1 MEDIA Cybernetics inc. USA）测量肌纤维直径。测量时，每张照片随机选择10个测量点取平均值。

1.3.4 透射电镜观察不同压力腌制的鸡胸肉[15]

将0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的样品于2.5%戊二醛（25%戊二醛溶液与0.1 mol/L、pH 7.4 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）按1∶9体积比混合即可）中4 ℃固定3 d，然后经PBS（pH 7.4）清洗3 次，再于1%饿酸中固定1.5 h，然后再经PBS清洗3 次，30 min/次；之后，乙醇逐级（30%、50%、70%、90%、100%、100%）脱水，每级20 min；最后用环氧丙烷置换。脱水后的样品于Epon-812树脂和丙酮等体积混合液中渗透4 h，再在纯Epon-812树脂中过夜渗透；然后将样品包埋，放入聚合器中聚合（35 ℃，24 h；45 ℃，24 h；60 ℃，48 h）聚合后的样品在实体显微镜下修块，半薄切片定位，LKB-V超薄切片机切片；超薄切片用醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色，自然干燥后在透射电子显微镜下拍照，用游标卡尺测量肌原纤维直径，肌节长度（两条Z线之间的距离），每张照片随机选择20 个测量点测量肌节长度，观察肌纤维的微观结构基本特性。

1.4 数据分析方法

所有数据均为4次重复的平均值，数据统计采用SAS 8.0软件进行单因素方差分析（one way ANOVA），差异的显著性采用Duncan’s多重检验（P＜0.05，差异显著） 。

2 结果与分析

2.1 不同压力对腌制鸡胸肉中水分存在状态的影响

图1 高压腌制鸡胸肉的NMR的反演图（n=4）Fig.1 Inversion map of NMR of chicken breast brined by high pressure (n = 4)

图2 高压腌制鸡胸肉NMR水分分布图（n=4）Fig.2 Water distribution of NMR in chicken breast brined by high pressure（n=4）

由图1可知，肉中的水分基本呈现出3 个波峰，第一个波峰在1～10 ms之间，第二个波峰在30～130 ms之间，第三个波峰则在150～305 ms之间。核磁共振能够表征氢核在磁场中的弛豫特性，进而根据弛豫特征将水区分为若干状态，以结合程度来分，肉品中水分可分为结合水、不易流动水和自由水，根据核磁弛豫时间可将T2分为T21、T22、T23，分别对应图1中1～10 ms、30～130 ms和150～305 ms之间的3 个波峰。

高压作用下鸡胸肉的微观结构变化可能导致内部毛细管分布改变，水的保持和体系毛细管作用相关。由图1可知，50 MPa和100 MPa腌制鸡胸肉时会缩短鸡胸肉的T2弛豫时间，与前人的研究结果相似：Bertram等[16]的研究表明高压处理会缩小牛肉的T2时间，这说明高压处理会使肌肉中的水分更加紧密地保留在网状蛋白中间，从而使肌肉的保水性增加。由图2可知，经过腌制后鸡胸肉的T21所占鸡胸肉总水分的百分含量几乎不变，这是因为这些水分都是结合水，与蛋白质分子表面紧密结合在一起。T22和T23的值和百分含量则不断变化，结合常压腌制发现，T22对应的不易流动水的百分含量随着压力的升高先增大后减小，150 MPa的不易流动水所占总水分的比例最大。T23对应的是自由水的百分含量则先减小后增大，150 MPa的自由水含量最低，300 MPa的自由水含量最高。

2.2 光学显微镜观察不同压力腌制鸡胸肉的结果

图3 高压腌制鸡胸肉肌纤维的变化（×400）Fig.3 Changes of muscle fi bers in chicken breast brined by high pressure (×400)

图3 是鸡胸肉在不同压力腌制条件下放大400 倍后微观结构变化的光学显微镜图，鸡胸肉经过高压腌制后，微观结构发生了很大的变化。50～150 MPa处理后，在光学显微镜下，各个肌肉组织结构有差异但不显著，鸡胸肉的肌细胞形状规则，排列有序；200 MPa鸡胸肉的肌纤维排列疏松，肌纤维之间肌束膜开始破裂，300 MPa时鸡胸肉的肌束膜也发生大量断裂和崩解，几乎消失。

图4 高压腌制鸡胸肉肌纤维直径的变化（n=4）=4Fig.4 Changes in diameters of muscle fi bers in chicken breast brined by high pressure (n = 4)

由图4可知，压力对腌制鸡胸肉的肌纤维直径影响显著（P＜0.05），随着腌制压力的升高鸡胸肉的肌纤维直径先增加后减小。100 MPa之前肌纤维直径随着压力的升高而增高，这从微观层面上解释了本课题组前期研究发现鸡胸肉肉质随着压力的升高而变老这一现象[12]。200 MPa以后肌纤维直径随着压力的增高而降低，但本课题组前期研究发现200 MPa以后鸡胸肉并没有变嫩[12]，这是因为200 MPa以后肌束膜发生破裂，导致肌纤维束松散，肌纤维直径并没有真正的变小。

2.3 透射电镜观察不同压力腌制鸡胸肉的结果

图5 高压腌制鸡胸肉肌纤维的纵切面变化Fig.5 Changes in longitudinal section of muscle fi bers in chicken breast brined by high pressure

不同压力条件下腌制鸡胸肉的微观结构如图5所示，0.1、50 MPa条件下腌制的鸡胸肉有清晰可见的M线、Z线，这些线附近的H带、I带，以及I带之间的A带。两条Z线之间的部分叫做肌节，很多个肌节单元组成了肌原纤维。100、150 MPa压力处理后鸡胸肉的H带已经开始模糊，但肌节仍然清晰可见。200 MPa时H带已经彻底消失，I带也在减小。300 MPa条件下腌制的鸡胸肉肌原纤维结构产生显著的变化，Z线和I带被彻底破坏，在Z线和M线附近形成了重聚体，肌纤维丝也发生了消融。

高压处理后肌肉微观结构的变化会因压力水平和肉类品种的不同而不同。Iwasaki等[17]用免疫电子显微镜观察高压处理后的鸡肉，证实用大于200 MPa的压力保压10 min可以破坏鸡肉肌原纤维的Z线。而对于猪肉，当压力升至400 MPa和500 MPa时才观察到A带断裂[18]。Villacís等[2]则用透射电镜观察到高压腌制火鸡胸肉时，150 MPa时肌原纤维发生溶胀，M线消失，Z线断裂，A带和I带缩短，肌节长度短于对照组，这是由高压的压缩作用引起的，Z线的破裂是因为与Z线相连的肌原纤维细丝的基本构成部分F-actin发生变性；300 MPa时肌原纤维发生巨大的变化，Z线和I带被彻底破坏，在Z线和M线附近形成一个非常密集的再凝集物质，从而使肉品的保水性下降。对于鱼肉来说，小于150 MPa的压力就可以导致Z线破坏和A带断裂，这可能是由于不同肉类肌原纤维蛋白结构不同所致，而150 MPa处理后，肌肉的肌节收缩，肌原纤维变粗，Z线、M线和H区消失，粗丝和细丝零乱交错，A带和I带断裂，经450 MPa处理后，肌原纤维的肌节己被彻底破坏，难以辨认A带和I带，肌原纤维间隙消失，蛋白质胶凝化现象严重[19]。因此，对于不同品种的肉，不同的压力强度和处理时间，会对肉的品质产生不同的影响。

图6 高压腌制鸡胸肉肌节长度的变化（n=4）Fig.6 Changes in sarcomere length of chicken breast brined by high pressure (n = 4)

肌纤维是禽肉的基本构造单位，其直径的变化反映了肌纤维特性的变化情况。许多研究表明，肌纤维的组织学特性与肌肉品质特性特别是食用品质性状密切相关[13]，嫩度决定于肌纤维和肉中的结缔组织，其中肌纤维的作用更大一些。一般认为，肌纤维丝越细，密度越大，系水力越强，肉质越细嫩。肌节长度也对嫩度具有很大程度的决定作用，肌节长度越长，肌肉越细嫩[20]。由图6可知，不同压力下鸡胸肉肌节长度具有显著的变化（P＜0.05），与常压腌制相比，50、100 MPa的肌节长度稍长，而150 MPa之后肌节长度则慢慢降低，这与150 MPa之后剪切力值的上升[6]有很大关系。

3 结 论

高压处理对腌制鸡胸肉的水分存在状态具有显著的影响（P＜0.05），150 MPa处理腌制鸡胸肉的不易流动水占总水分的百分含量最高，自由水占总水分的百分比最低。压力小于150 MPa的处理组在光学显微镜下各个肌肉组织结构没有显著差异且鸡胸肉的肌细胞形状规则，排列有序，100、150 MPa的H带已经开始模糊，但肌节仍然清晰可见，200 MPa时H带已经彻底消失，I带也在减小，300 MPa时肌原纤维结构产生显著的变化，Z线和I带被彻底破坏，在Z线和M线附近形成了重聚体，肌纤维丝也发生了消融，因此150 MPa处理组的鸡胸肉肌肉结构保持较好。

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Effect of High Pressure Brining on Microstructure of Chicken Breast

LENG Xuejiao1,2, DENG Shaolin2, ZHANG Lin2, HUANG Ming2,*, ZHOU Guanghong2
(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The objective of this study was to investigate the effect of high pressure brining on microstructure of chicken breast. Chicken breast was brined under different pressure levels (0.1, 50, 100, 150, 200 or 300 MPa for 20 min) in 40 g/L salt solution. Nuclear magnetic resonance (NMR), optical microscope and transmission electron microscopy (TEM) were used to characterize the microstructure of chicken breast. The results showed that high pressure brining had signifi cant effects on the state of water in chicken breast (P < 0.05). At 300 MPa, T22was shifted towards to slow relaxation direction, and more immobile water than free water at 150 MPa was observed. At a pressure less than 150 MPa, some differences but not obvious in the muscle cell shape were observed. Chicken breast muscle fi ber arranged loosely at 200 MPa, and muscle fi ber perimysium began to burst at 200 MPa. When brining at 300 MPa, the perimysium of chicken breast muscle become disintegrated. Chicken myofi brillar structure brined at 300 MPa had a signifi cant change; Z line and I band were completely destroyed, thus forming a reunion body near them, and the ablation of fi bers was also observed. Therefore, 150 MPa could provide better maintenance of muscle fi ber structure.

high pressure; brining; chicken breast; microstructure

TS251.1

A

1002-6630（2015）01-0099-05

10.7506/spkx1002-6630-201501019

2014-03-06

江苏省自然科学基金项目（BK2009314）；南京中医药大学校青年自然科学基金项目（13XZR29）

冷雪娇（1988—），女，助理实验师，硕士，研究方向为食品安全与工艺。E-mail：leng.xuejiao2008@163.com

*通信作者：黄明（1970—），男，教授，博士，研究方向为肉类质量与安全控制。E-mail：mhuang@njau.edu.cn