黄连素对A549细胞增殖和凋亡的影响

孙秀梅，郑祎

（潍坊医学院附属医院肿瘤科，山东 潍坊 261000）

·论著·

黄连素对A549细胞增殖和凋亡的影响

孙秀梅，郑祎

（潍坊医学院附属医院肿瘤科，山东 潍坊 261000）

目的探讨黄连素（berberine）对人肺腺癌细胞株A549的作用及其机制。方法将对数生长期A549细胞分成对照组和黄连素组。对照组细胞常规培养，黄连素组细胞培养体系中分别加入黄连素100μmol/L。各组细胞培养24 h后，利用MTT检测细胞增殖；流式检测细胞凋亡，RT-PCR检测细胞JAK2和STAT3 mRNA水平；Western blot检测细胞中JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白的变化。结果与对照组相比，黄连素组A549细胞增殖率明显下降（P＜0.05），凋亡率明显升高，A549细胞JAK2与STAT3 mRNA表达水平差异无统计学意义。Western blot检测显示，黄连素组A549细胞JAK2和STAT总蛋白无明显变化（P＞0.05），但p-JAK2和p-STAT3总蛋白明显增加（P＜0.05）。结论黄连素能抑制A549细胞增殖，促进A549细胞凋亡，其作用可能是通过激活JAK2/STAT3信号传导通路实现的。

黄连素；A549细胞；增殖；凋亡；JAK2/STAT3

20世纪60年代以来，化疗药物治疗肺癌获得巨大成功，推动了国内外肿瘤治疗，但有研究和临床发现化疗药物容易引起严重的副作用，如急性肝损伤、急性肾损伤等，若不及时诊治可危及生命[1]。因此，寻找新的高效低毒分化诱导剂与分化疗法，已成为肿瘤基础与临床学者研究的重点之一。目前，中药诱导分化的研究尚不多见。黄连素是我国应用已久的一种中药，又称小檗碱（berberine），是从黄连、黄柏等中药中提取的季铵类化合物，以往临床上主要用来清热解毒，抗菌消炎[2]。研究发现，黄连素具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用[3-5]。同时，肺癌的发生被认为是细胞凋亡与细胞增殖平衡失调的结果[6]。本研究以人肺腺癌A549为靶细胞，探讨黄连素对人肺腺癌细胞株A549的作用及其作用机制。

1 资料与方法

1.1药品与试剂

A549（武汉病毒研究所），黄连素（武汉银河生物制药有限公司），RPMI 1640培养基（美国Gibgo公司），小牛血清（杭州四季青公司），12孔培养板（美国Falcon公司），β-actin抗体（Abmart，China），p-JAK2抗体（CST，USA），JAK2抗体（CST，USA）p-STAT3抗体（CST，USA），STAT3抗体（CST，USA）。TRIzol reagent（Invitrogen，USA），逆转录试剂盒（Gene Copoeia，USA），SYB R green（Takara，Japan），Q-PCR仪（BIO-RAD），蛋白裂解液RIPA（碧云天生物技术有限公司），蛋白酶抑制剂cocktail及Western blot凝胶制备试剂盒（武汉谷歌生物技术有限公司），BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术有限公司）。qPCR引物（擎科生物技术有限公司），酶标仪（Thermo Fisher）。

1.2细胞培养

A549细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，加入青霉素（100 u/ml）和链霉素（100 u/ml），在37℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱中培养。

1.3仪器

二氧化碳细胞培养箱（美国Forma scientific公司），倒置显微镜、激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司），酶标仪（Thermo Fisher）。PVDF膜（Roche），ECL试剂盒（Bi-pech），胶片及化学发光仪（Kodak），实时定量RT-PCR仪（BIO-RAD）。

1.4MTT法检测细胞增殖

取对数生长期A549细胞，接种于12孔板内，调整密度为2×105个/ml，每孔90μl，实验组加入黄连素（100μmol），对照组细胞不加药物，另设空白组（只加培养基，不加细胞和药物），每组均设3个复孔。12孔板置于37℃、5%二氧化碳培养箱培养48 h后，加入5mg/ml的MTT溶液20μl/孔，继续培养4h，然后加入三联裂解液[10%SDS+5%异丁醇+1%盐酸（10 mol/L），100μl/孔]，37℃放置过夜后，用酶标仪于波长570 nm处读取吸光度（optical density，OD）值，根据OD值计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）=[对照孔OD值-实验孔OD值]/[对照孔OD值-空白孔OD值]×100%。

1.5Annexin-V双染法检测细胞凋亡

取对数生长期的A549细胞接种于6孔板中，调整密度为1×105个/ml。实验分为两组：对照组细胞常规培养；黄连素组细胞培养体系中加入黄连素，终质量浓度为0.4 g/L。细胞培养24 h后，收集各组所有悬浮细胞，调整细胞密度为1×105个/ml，取1 ml细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，去培养基，加RNA酶，37℃水浴1h，放入冰浴加入0.5mg/L碘化丙啶（PI）及Annexin V，流式细胞仪检测。采用CELIQUEST软件分析细胞凋亡率。

1.6Western bIot检测黄连素细胞JAK2、STAT3、p-JAK2及p-STAT3表达

将各组收集的细胞用预冷的PBS清洗后，按照蛋白裂解液RIPA操作说明提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，将各组蛋白浓度调成一致，沸水煮5 min，待用。取各组细胞总蛋白样品80μg，以样品中的βactin为内参，经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，然后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭2 h，分别加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释JAK2抗体（1∶1 000），p-JAK2（1∶500），STAT3（1∶1 000），p-STAT3（1∶500），β-actin（1∶3 000）抗体，4℃孵育过夜。PBS洗膜3次，10 min/次，根据一抗的来源，再分别加入适量含2%脱脂奶粉的PBS稀释的HRP标记羊抗兔IgG（1∶500）、HRP标记羊抗鼠IgG（1∶5 000）室温下作用2 h，PBS洗膜3次，10 min/次，ECL化学发光显色、压片、显影、定影、胶片扫描保存。用Gel Pro Analy zer（Ver 3.0）软件测定蛋白条带灰度值JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3条带灰度值与β-

actin内参条带灰度值的比值分别将上述蛋白表达量化。

1.7RT-PCR PCR检测JAK2和STAT3 mRNA水平

按照总RNA提取试剂盒（TaKaRa）说明书提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测量浓度，逆转录以及扩增反应按试剂盒说明书进行操作，实时定量PCR。引物均由invitrogen公司合成。管家基因βactin作为内参对照基因，用得到的各样本的Ct值按公式2-ΔΔCT计算相对表达量。RT-PCR检测的引物序列见表1。

表1 RT-PCR检测的引物序列

1.8统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，资料用单因素方差分析（ANOVA），多个样本之间的两两比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1黄连素对A549细胞增殖的影响

MTT检测实验结果显示，与对照相比，给予黄连素的实验组增殖率明显降低（P＜0.01）。对照组和黄连素组增殖率分别为（89±6）%和（45±5）%。见图1。

图1 MTT检测黄连素对A549细胞增殖的影响

2.2黄连素对A549细胞凋亡的影响

流式检测实验结果显示，与对照相比，给予黄连素的实验组凋亡率明显增高（P＜0.001）。对照组和黄连素组凋亡率分别为（8±3）%和（55±10）%。见图2。

图2 流式检测黄连素对A549细胞凋亡的影响

2.3黄连素对A549细胞JAK2、STAT3 mRNA表达的影响

RT-PCR检测结果显示，对照组细胞JAK2、STAT3 mRNA的表达水平与黄连素处理组相比，差

异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 RT-PCR检测黄连素对A549细胞JAK2、STAT3 mRNA表达的影响

2.4黄连素对A549细胞JAK2、STAT3蛋白表达的影响

Western blot检测显示，与对照组比较，经黄连素作用A549细胞24 h后，JAK2、STAT3蛋白无明显变化（P＞0.05），p-JAK2、p-STAT3明显增加（P＜0.05）。见图4。

图4 Western bIot检测黄连素对A549细胞JAK2、STAT3蛋白表达的影响

3 讨论

目前，肺癌治疗大多采用传统的大剂量联合化疗和手术切除，但不良反应大，尤其对肝脏和肾脏很大损害，且复发率高[1]。从祖国医学宝库中挖掘抑制肺癌细胞恶性增殖的方法是研发高效低毒的抗肺癌药物的有效途径之一[2]。黄连素是临床常用的一种中药，目前研究发现有促进细胞凋亡，抑制细胞增殖的作用[2-5]。近年来研究表明，肺癌不仅是增殖、分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病，细胞凋亡的减少可引起肺癌的发生，且通过逃避凋亡而促进细胞的恶性转化[6]。

JAK2/STAT3是多种细胞发挥介导作用的信号通路，信号通路涉及细胞生长、细胞凋亡（促凋亡）、细胞周期进程、分化、转录、翻译和糖代谢[7]。研究发现JAK2/STAT3信号通路可以调节肿瘤细胞增殖[7]、分化和凋亡，尤其与肺癌密切相关[8-10]。

笔者通过MTT检测发现黄连素可以明显抑制A549细胞增殖，流式发现黄连素明显增加A549细胞凋亡率。Western blot发现JAK2和STAT3明显活化，因此可以推测黄连素可以通过激活JAK2/STAT3

信号通路下调增殖，促进凋亡，从而达到治疗肺癌的目的。

综上所述，黄连素可能是通过激活JAK2/STAT3信号通路来抑制NCI-H446细胞增殖和促进凋亡。但是黄连素是否直接作用于JAK2信号分子还是通过调节其上游激酶和/或信号分子而间接发挥作用仍不清楚，尚需进行更深入的研究。

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（张蕾 编辑）

EEffect of Berberine on proliferation and apoptosis of A549 cells

Xiu－mei SUN,Yi ZHENG
(Department of Oncology,the Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang,Shandong 261000,P.R.China)

【Objective】To investigate the effect of Berberine on the human lung adenocarcinoma cell line A549 and its mechanisms.【Methods】The A549 cells at logarithmic growth phase were divided into control and Berberine groups.The cells in the control group were normally treated and the cells in the Berberine group were incubated with Berberine(100 μmol/L).MTT and flow cytometry were used to examine the proliferation and apoptotic changes of A549 cells respectively in both groups after incubation for 24 h.The mRNA levels of JAK2 and STAT3 were detected by RT－PCR.The changes of JAK2,STAT3,p－JAK2 and p－STAT3 proteins were detected by Western blot.【Results】Compared with the control group,the proliferation rate of A549 cells was significantly decreased(P＜0.05),but the apoptotic rate was significantly increased in the Berberine group(P＜0.05).There were no differences in the mRNA levels of JAK2 and STAT3 between both groups(P＞0.05).Western blot showed that there was no difference in the expression of total JAK2 or STAT3 protein between both groups(P＞0.05),but the Berberine group had higher expression levels of p－JAK2 and p－STAT3 proteins than the control group(P＜0.05).【Conclusions】Berberine could inhibit the proliferation and promote the apoptosis of A549 cells,and the effect may be achieved through activating JAK2/STAT3 signal transduction pathway.

Berberine;A549 cell;proliferation;apoptosis;JAK2/STAT3

R734.2

A

1005-8982（2015）24-0009-05

2015-03-18

郑祎，Tel：15866537933