鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性试验

文│段俊秀（山西省太谷县畜牧兽医中心）

鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性试验

文│段俊秀（山西省太谷县畜牧兽医中心）

鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏杆菌某些血清型菌株引起的一类疾病的总称。常引起家禽胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、关节炎、肠炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎等一系列疾病，对养鸡业的危害巨大。本病的感染途径很多，主要通过消化道和呼吸道感染，也可通过种蛋垂直传播等。该病可原发，也可继发或并发，各类年龄和品种的鸡都能感染本病，是养鸡业中最常见、危害最严重的疾病之一。一年四季均有发生，没有明确的季节性，但冬季和春季多发，该病症状一般均呈典型经过。鸡只精神委顿、羽毛蓬乱、呼吸困难和食欲废绝。黄、白、绿稀便交替出现。急性型往往发病后一周内即死亡，亚急性或慢性型多发于成年蛋鸡，患病的鸡精神不振，食欲减少，饮水量增加，逐渐消瘦和下痢，但死亡率不高。

近年来，随着集约化养禽业的迅速发展，该病已成为困扰养禽业健康发展的主要因素之一。目前我国已分离到的鸡致病性大肠杆菌血清型多达50多个，各地分离的菌株血清型不尽相同，鸡源大肠杆菌（E.coli）常见的致病性血清型是01、02、035和078，但在同发病地区或鸡场也有其他血清型为优势致病性血清型。

该病的防治主要使用抗菌药、抗生素，药物的大量和频繁使用，导致耐药性微生物的出现，这不仅给畜禽疫病的治疗带来困难，而且会将致病性耐药菌传递给人类，甚至能将内源耐药菌群的耐药基因扩散到环境和传递给人类致病菌，使抗菌药对人类疾病的治疗效果下降或消失，这是严重威胁人类健康的公共卫生问题。但是基层缺乏实验室化验的条件，在生产上盲目滥用药物，造成大肠杆菌耐药菌株不断产生，致使该病治疗效果下降，给养鸡业造成了严重的经济损失。同时，抗菌药物在畜禽体内的残留给养禽业的持续发展和人类的身体健康带来潜在危害。因此，分离鉴定鸡大肠杆菌血清型及耐药性现状，以期为临床防治本病提供科学依据。

一、材料与方法

1.试验材料。

（1）病料来源。样品来自太谷县周边几个鸡养殖场，共采样25份，经临床诊断为鸡大肠杆菌病，用灭菌棉拭子插入患腹泻病鸡的粪便或脏器中，旋转后取出，接种到装有无菌生理盐水的5毫升离心管中，4℃保存，以备检验。

（2）培养基。营养琼脂、麦康凯琼脂、普通肉汤、伊红美蓝琼脂和细菌微量生化反应管；甲基红（M.R）试剂、乙酰甲基甲醇（V-P）试剂、靛基质试验用培养基等均按照常规方法配制。细菌生化微量鉴定管。

（3）大肠杆菌O抗原定型血清诊断液。大肠杆菌O抗原定型血清诊断液购于中国兽医药品监察所。

（4）试验动物。体重20～25克小白鼠20只，健康活泼，购自山西医科大学动物试验中心。

（5）试验药品。选择硫酸阿米卡星、盐酸左旋氧氟沙星、氟苯尼考、新霉素、头孢曲松钠、头孢噻噁钠、卡那霉素、头孢噻呋钠、庆大霉素、氨苄西林、阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星、链霉素、先锋Ⅴ号等药物进行。

2.试验方法。

（1）细菌分离培养。所采集病料取0.5g，加适量稀释液研磨，10倍稀释后过滤、离心，取上清液在无菌工作台中将样品用接种环接种于普通培养基上，37℃恒温培养18小时，观察细菌生长情况、菌落特征。然后挑取单个菌落接种于麦康凯琼脂平板，37℃恒温培养24小时后挑取可疑、红色、中等大小、光滑菌落进行革兰染色、镜检。革兰染色情况、形态、大小等均符合大肠杆菌特征的菌株初步确定为大肠杆菌。对疑似大肠杆菌进行菌种保存。

（2）生化试验。将分离纯化的细菌在无菌条件下进行糖发酵试验、甲基红试验、二乙酰（V-P）试验、吲哚试验、硫化氢试验、尿素酶试验、枸橼酸盐利用试验检测。

（3）致病性试验。20只小白鼠分成2组，每组10只。Ⅰ组为试验组，用鸡大肠杆菌肉汤培养物接种，腹腔注射0.3毫升/只；Ⅱ组为对照组，腹腔注射灭菌生理盐水0.3毫升/只。注射后每天观察2次，连续观察7天。剖检病、死鼠，取死鼠的肝脏进行涂片染色镜检，再将其接种于麦康凯琼脂，挑取可疑菌落进行分离培养，进行观察。

（4）血清型鉴定。按大肠杆菌O抗原定型血清诊断液使用说明书操作。首先将分离的细菌进行玻板凝集反应，初步筛选疑似O血清型菌株，然后通过试管凝集反应进一步确定其血清型。

（5）耐药性试验。采用纸片法，从细菌纯培养物上，选择形态完整的菌落接种于5毫升肉汤培养基中，37℃培养6～8小时后，肉汤呈混浊状。振荡摇匀，用灭菌棉拭子蘸取菌液，均匀涂布于营养琼脂平板上，分别记录、编号。将镊子于酒精灯火焰上略停灭菌，取药敏片贴到平皿培养基表面，在平皿中央贴一片，外周可等距离贴6片。置于37℃培养18～24小时后观察结果，用游标卡尺测量抑菌圈直径。判定标准：抑菌圈直径大于20毫米为高度敏感；抑菌圈直径在10～20毫米之间为中度敏感；抑菌圈直径小于10毫米为耐药。

二、结果与分析

1.细菌的分离培养。从25份病料中，分离出大肠杆菌11株，分离率为44%。分离菌在营养琼脂上生长24小时后，形成圆形、边缘整齐、隆起、光滑、湿润、灰白色的菌落，直径为2～3毫米；在麦康凯琼脂上形成红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐的小菌落；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落；在普通肉汤中呈均匀浑浊，管底有灰白色沉淀，振荡呈云雾状散开。革兰染色镜检可见革兰阴性、无芽孢、短小、两端钝圆的短杆菌。

2.生化试验。11株分离菌对葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇产酸产气；M.R、吲哚试验结果阳性；对枸橼酸盐、明胶、V-P反应阴性；符合大肠杆菌生化特性。

3.致病性试验。Ⅰ组2只小鼠5小时内死亡，5只24小时内死亡，3只36小时内死亡。病理剖检可见肝脏肿大，有坏死灶及出血点；肠严重鼓气，心包瘀血，肺出血，脾脏瘀血。采取死亡小鼠肝和脾接种在麦康凯琼脂平板及普通肉汤，37℃培养24小时，有细菌生长。革兰氏染色及生化鉴定表明此菌与接种细菌为同种细菌。说明该菌对小鼠具有较强的致病力。Ⅱ组饲养7天后全部存活，剖检未见明显病变。

4.血清型鉴定。11株大肠杆菌主要血清型是O157。

5.药敏试验结果。18株大肠杆菌对14种抗生素有不同程度的耐药。具体结果见表1。

表1 大肠杆菌分离株药敏试验结果

三、结论与讨论

1.分离株鉴定及发生感染的原因。经过细菌分离培养、生物学特性的鉴定，可以得知引发该地区肉鸡发病死亡的致病菌为致病性大肠杆菌，且其血清型为O157。大肠杆菌为条件性致病菌，而现在肉鸡饲养主要采用网上平养的方式，饲养密度大，鸡舍空气污浊，通风不良，光线照射不足，肉鸡生长速度快，耗氧量大以及环境卫生与饲养管理不善等因素常可导致机体抵抗力下降，肠道正常菌群的微生态平衡被破坏，致使细菌大量繁殖而发病。因此，平时应加强饲养管理，搞好鸡舍及周围环境的卫生；发病时，应及时采取隔离措施，并对鸡舍及污染场地进行清理消毒。

2.耐药菌株产生的原因。从药敏试验结果可见，太谷县鸡场的大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星、链霉素、先锋Ⅴ号等有耐药性，对盐酸左旋氧氟沙星、头孢曲松钠、头孢噻噁钠、头孢噻呋钠、卡那霉素、庆大霉素等中度敏感，对氟苯尼考、新霉素、硫酸阿米卡星高度敏感。结果表明前几次治疗使用的敏感药物这次药敏试验结果就不理想，主要原因是临床上长期大量和不规范的使用抗菌药物，致使大肠杆菌耐药菌株不断产生，耐药谱也越来越广泛。

很多养殖户为了达到治疗的效果，盲目加大用药剂量，不仅破坏鸡肠道的正常菌群，而且间接影响人体健康，最后会导致药物残留。因此，在选择抗菌药物上最好考虑采取联合用药、交叉用药、轮换用药的方式，一方面可以充分发挥抗菌药物之间的协同作用，增加疗效；另一方面可以避免因细菌长期与某一种药物接触而增强耐药性。

大肠杆菌耐药性的出现可能与菌株长期处于多种抗生素选择的环境中，其耐药基因通过染色体或耐药质粒在菌群间广泛传播或扩散有关。加强生物安全措施，合理使用疫苗，选择有效的抗生素，才是控制大肠杆菌最经济有效的方法。

如果使用疫苗，由于地区不同，细菌血清型有差异，建议有条件的肉鸡场可以采用自家苗免疫，这样效果可能会可靠。但是如果发病鸡出现纤维素性肝周炎和心包炎时，治疗效果就不理想，总之，鸡大肠杆菌病流行病学具有极其复杂的特征，这也是鸡大肠杆菌病难以根除的关键所在。只有定期对本地区鸡场的大肠杆菌进行分离鉴定，配以药敏试验用药，同时加强管理等综合措施，才能收到良好的防控效果。