Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌及其耐药性研究

刘慧梅，颜学兵

1.徐州医学院 研究生学院（徐州 221000）；2.徐州市传染病医院 结核科（徐州 221000）；3.徐州医学院附属医院 感染科（徐州 221000）

结核病是结核分枝杆菌（M.tubercutosis，MTB）感染所引起的重大传染性疾病。我国是全球22个结核病严重流行国家之一，同时也是27个耐多药结核病严重流行国家之一［1］。早期快速诊断结核病是控制结核疫情的重要手段，传统诊断结核病的实验室金标准为MTB培养和抗酸染色法，但MTB培养耗时长，对细菌要求高，活菌不易获取［2－3］；抗酸染色法虽快速、经济，但灵敏度较低［4－5］，因此有必要寻求一种快速诊断结核病的新手段。随着实验室诊断技术不断发展，利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术（Xpert MTB/RIF）逐渐受到国内外学者普遍关注，国外研究［6］表明，Xpert系统操作简单、检测快速、诊断价值较高。本研究利用该技术对138例结核病患者进行检测，评价其临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2014年10月至2015年2月于徐州市传染病医院就诊的151例可疑结核患者，按照中华结核病诊治指南诊断标准进行诊断，确诊结核138例，其中儿童结核28例，成人结核110例；肺结核112例，肺外结核26例（包括结核性胸膜炎12例，结核性腹膜炎8例，结核性脑膜炎2例，淋巴结核1例，肾结核2例，输卵管结核1例）；男85例，女53例，年龄（42.1±18.2）岁。非结核13例，其中肺炎7例，非结核分枝杆菌病3例，恶性胸腔积液2例，肺癌1例；男6例，女7例；年龄（42.9±8.1）岁。

1.2 方法

1.2.1 标本留取 肺结核、肺炎、肺癌以及非分枝杆菌病患者收集痰液标本，结核性胸膜炎、恶性胸腔积液患者收集胸腔积液标本，结核性腹膜炎收集腹腔积液标本，淋巴结核收集脓液标本，输卵管结核收集盆腔积液标本，肾结核收集尿液标本，结核性脑膜炎收集脑脊液标本。每个患者标本一式3份，分别用于 MTB培养、涂片检查和 Xpert MTB/RIF检测。

1.2.2 痰培养、涂片镜检 按照中国防痨协会基础专业委员会制定的实验室检查规程进行［7］。

1.2.3 Xpert检测 取1mL标本置于有螺旋盖的前处理器中，然后以1∶2的比例，往标本中加入处理液，旋紧前处理管，在涡旋振荡器上涡旋振荡15～30s，室温静置15min，使标本充分液化。再将混合液转移至反应盒中，将反应试剂盒放入Gene Xpert仪器中，按说明书进行检测，约2h即可读取结果。结果判断依照探针的循环阈值（Ct值），当内对照探针Ct值≤38为阳性，反之则无效（提示标本的DNA提取不合格或含有PCR抑制物）。5个探针中至少2个探针Ct值≤38即为检测到MTB，可进一步按照Ct值对MTB进行半定量：Ct值＜16为高含量，16～22为中等含量，22～28为低含量，＞28为极低含量。检测利福平耐药的基础在于MTB特异性分子信标早期Ct值和晚期Ct值之差，即△Ct值。系统设置的结果判断标准为：△Ct≥3.5，提示对利福平耐药；△Ct＜3.5，提示对利福平敏感。由于终止循环数为38个循环，因此当早期探针Ct值＞34.5或晚期探针Ct值＞38时，利福平耐药结果为不确定。

1.2.4 药敏试验 临床分离MTB新鲜培养液，磨菌，制备成1mg/mL菌悬液，稀释至适当浓度，接种至含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基表面。接种后的培养基置于37℃培养，4周后报道结果。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件计算Xpert系统检测MTB的敏感度和特异度，并作Kappa分析，K≥0.4表示一致性好。

2 结果

2.1 Xpert MTB试验检测结果

采用Xpert MTB试验检测151例可疑结核病患者，其中涂阳39例，涂阴112例。以液体变色培养基培养结果为金标准，Xpert MTB试验检测涂阳患者 MTB 灵敏度为86.2%（25/29），特异度为70.0%（7/10）；检测涂阴患者 MTB灵敏度为0.0%（0/4），特异度为80.6%（87/108）；全部患者检测的灵敏度为75.8%（25/33），特异度为79.7%（94/118）（表1）。对Xpert MTB试验和液体培养进行Kappa检验，K＝0.472，两者检测结果一致性好。

表1 Xpert MTB检测MTB结果（例）

2.2 Xpert RIF检测结果

33例培养阳性标本中，比例法检测出利福平耐药菌5株，耐药率为15.2%（5/33）。以比例法药敏试验为金标准，Xpert RIF试验检测利福平耐药的灵敏度为80.0%（4/5），特异度为89.3%（25/28）（表2）。对Xpert RIF试验和比例法药敏试验进行Kappa检验，K＝0.595，两种检测结果一致性好。

表2 Xpert RIF检测结果（例）

3 讨论

Xpert MTB/RIF核酸检测技术采用Gene Xpert检测系统，是一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，以利福平耐药相关rpoB基因为靶基因，可在2h内同时检测MTB和利福平耐药情况［8］。由于大多数利福平耐药菌株都对异烟肼耐药，因此利福平耐药情况在一定程度上能作为耐多药结核病的检测指标［9］。

本研究结果显示，以液体变色培养基培养结果为金标准，Xpert MTB/RIF试验检测MTB灵敏度为75.8%，特异度为79.7%。以MTB培养为金标准，Boehme等［10］和伊慧霞等［11］用Xpert MTB/RIF试验检测MTB的敏感度和特异度均达到90%以上，明显高于本研究，可能与以下原因有关：1）Boehme与伊慧霞等研究病例均为成人，而本研究由于样本量较少，一并加入儿童病例，且儿童病例占患者总数的20%左右。国外Nicol等［12］对儿童结核患者行Xpert试验发现，其灵敏度和特异度明显低于成人；2）Boehme等的试验结果为重复试验两次以上后记录的最后检测结果，本研究仅检测1次，而Xpert MTB/RIF检测次数的增加会在一定程度上加大其检测MTB的灵敏度和特异度［6］。本研究MTB培养阳性率较低，其原因可能是由于本研究样本量较少（仅150余例）以及标本留取种类较多，其中胸腔积液和腹腔积液很难检测出MTB。

本研究对涂片阳性患者诊断灵敏度为86.2%，而对培养阳性、涂片阴性的4例标本行Xpert MTB/RIF检测，均未发现MTB感染，其原因可能是培养涂阴标本过少以及Xpert MTB/RIF试验检测次数少，从而导致假阴性结果。国外已经在多个地区开展Xpert MTB/RIF试验诊断结核病临床价值的研究，对涂片阳性标本的敏感度为98%～100%，涂片阴性标本的敏感度为57%～83%［13－14］。上述研究结果均表明，Xpert MTB/RIF试验对涂片阳性标本的诊断灵敏度明显高于涂片阴性标本，本研究也支持上述结论。

Boehme等［10］研究发现，以比例法药敏试验作为检测利福平耐药的金标准，Xpert MTB/RIF试验能够准确鉴定出97.6%的利福平耐药菌株，同时正确排除98.1%的利福平敏感菌株。张治国等［15］研究结果表明，Xpert MTB/RIF试验检测利福平耐药的敏感度为89.1%，特异度为96.3%，均高于本研究，其原因可能是部分标本中MTB含量较低，从而影响Xpert MTB/RIF试验检测利福平耐药的准确性。Lawn等［16］研究发现 Xpert MTB/RIF试验过程中探针B循环阈值存在延迟现象，探针B异常可能导致Xpert MTB/RIF试验出现利福平耐药假阳性结果。因此世界卫生组织建议，临床应用Xpert MTB/RIF试验检测出利福平耐药后，在进行药物治疗的同时，需行药敏试验验证其检测结果的真实性。

虽然Xpert MTB/RIF试验检测成本较高，但与传统的实验室诊断技术相比，该方法具有较高的灵敏度和特异度，且操作简单，操作人员经简单培训即可独立完成整个操作流程，短时间内即可获取检测结果，不会延误初诊患者的最佳治疗时间。尤其在落后地区或基层医疗机构，很多先进的实验室诊断技术难以开展，Xpert MTB/RIF检测技术在上述地区具有一定的应用前景。

［1］严永华，杨春梅，徐涛，等.四川结核病患者结核分析杆菌耐药状况分析［J］.成都医学院学报，2012，7（1）：58－60.

［2］王永忠，柳龙根，张宏宇，等.结核分枝杆菌实时荧光核酸恒温扩增检测方法的建立及应用［J］.江苏医药，2011，37（23）：2820－2822.

［3］郑强，李朝金，苟莉，等.多种肺结核临床实验室诊断方法的比较分析［J］.国际检验医学杂志，2014，35（21）：2941－2942.

［4］雷云.荧光PCR诊断肺结核的临床应用研究［J］.临床肺科杂志，2014，19（7）：1278－1279.

［5］张玉平，丁显平，张丽嫒，等.T－SPOT.TB、痰涂片和 TBDNA检测在肺结核诊断中的比较研究［J］.成都医学院学报，2013，8（1）：49－51.

［6］夏辉，赵雁林.Xpert MTB/RIF在我国的应用前景［J］.实用医学杂志，2013，29（23）：3799－3800.

［7］中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程［M］.北京：中国教育文化出版社，2006.

［8］尹青琴，申阿东.Xpert MTB/RIF试验在结核病诊断中的研究现状［J］.中华结核和呼吸杂志，2012，35（5）：363－365.

［9］Mokrousov I，Otten T，Vyshnevskiy B，et al.Allele－specific rpoB PCR assays for detection of rifampin－resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears［J］.Antimicrob Agents Chemother，2003，47（7）：2231－2235.

［10］Boehme CC，Nabeta P，Hillemann D，et al.Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance［J］.N Eng J Med，2010，363（11）：1005－1015.

［11］伊惠霞，侯新月，王泉，等.Xpert MTB/RIF系统快速检测结核分枝杆菌及利福平耐药性研究［J］.新疆医科大学学报，2014，37（12）：1643－1646.

［12］Nicol MP，Workman L，Isaacs W，et al.Accuracy of the Xpert MTB/RIF test for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children admitted to hospital in Cape Town，South Africa：a descriptive study［J］.Lancet Infect Dis，2011，11（11）：819－824.

［13］Marlowe EM，Novak－Weekley SM，Cumpio J，et al.Evaluation of the Cepheid Xpert MTB/RIF assay for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in respiratory specimens［J］.J Clin Microbiol，2011，49（4）：1621－1623.

［14］Armand S，Vahuls P，Delcroix G，et al.Comparison of the Xpert MTB/RIF test with an IS6110－TaqMan real－time PCR assay for direct detection of Mycobactenium tuberculosis in respiratory and nonrespiratory specimens ［J］.J Clin Microbiol，2011，49（5）：1772－1776.

［15］张治国，欧喜超，孙倩，等.利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的研究［J］.中国防痨杂志，2013，35（1）：13－16.

［16］Lawn SD，Nicol MP.Xpert（R）MTB/RIF assay：development，evaluation and implementation of a new rapid molecular diagnostic for tuberculosis and rifampicim resistance［J］.Future Microbiol，2011，6（9）：1067－1082.