鱼藤酮诱导PC12细胞自噬的初步研究＊

刘 腾，黄永秀，王 丹，崔涌泉，王建东△，张 红△

1.成都医学院 检验医学院（成都 610500）；2.成都医学院 生物医学系（成都 610500）；3.中国人民解放军第37医院 检验病理科（雅安 625000）

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是常见的一种影响中老年运动功能的中枢神经系统疾病。流行病学调查结果［1］显示，这种疾病主要发于老年人群，随着我国人口老龄化速度加快，其发病率呈现递增趋势。已有研究［2－3］认为，细胞内线粒体代谢异常是导致PD发生的一个重要环节。有研究［4］表明，细胞内的受损线粒体主要通过自噬途径降解，因此，自噬途径的异常可以阻碍受损线粒体的降解，从而导致PD发生。

自噬（autophagy）是细胞内一种依赖溶酶体的物质降解途径，也是细胞在外界环境刺激以及生理病理调控下的自我保护过程，自噬不足或过度自噬都会导致细胞死亡，这也是许多疾病的重要致病机制。自噬主要的研究方法如电镜观察细胞超微结构、Western blot检测自噬相关蛋白、细胞免疫荧光检测自噬斑等，均已广泛应用于细胞自噬的研究［5］。

近年来研究［6－7］发现，鱼藤酮可对机体的神经系统功能产生影响，它可选择性聚集在线粒体等细胞器，抑制复合体Ⅰ活性，损害细胞氧化磷酸化，从而诱导自噬发生。农业生产中的很多农药含有鱼藤酮，从而使人们接触鱼藤酮的机会大大升高。本研究通过探寻鱼藤酮对PC12细胞自噬的影响，为治疗PD提供更多的理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

PC12细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。稳定转染pEGFP－LC3质粒的PC12细胞株为成都医学院生物医学系生物技术实验室构建并保存。DMEM完全培养基和胎牛血清购自GIBCO公司。BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG购自碧云天生物科技研究所。兔抗LC3B多克隆抗体购自Novus抗体公司，小鼠抗β－actin单克隆抗体购自成都正能生物技术有限责任公司。PVDF膜和ECL化学发光试剂购自Millipore公司。鱼藤酮购自Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Western blot检测蛋白表达 取对数生长期的PC12细胞，按照3×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，进行实验分组。浓度梯度组：分别加入终浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10μmol/L的鱼藤酮处理细胞，处理12h后收集各组细胞。时间梯度组：加入终浓度为1μmol/L的鱼藤酮，分别处理0、2、6、12、18、24h，收集各组细胞。在各组细胞中加入ripa裂解液，冰上裂解细胞30min，于4℃，14 000 g，离心半径10cm，离心15min，收集裂解上清液，BCA法测定蛋白浓度。SDS－PAGE电泳，每组上样60μg/泳道，PVDF膜湿转60～80min，分别加兔抗LC3B抗体（1∶1 000）及小鼠抗β－actin抗体（1∶10 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，分别加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶2 000）或山羊抗小鼠IgG（1∶2 000），37℃，孵育1h，TBST洗膜3次，ECL化学发光法检测相关蛋白表达情况。

1.2.2 细胞荧光技术检测细胞自噬水平 取对数生长期的PC12细胞，接种于放置了多聚赖氨酸包被圆玻片的24孔板中，接种量5×104个/孔，37℃，培养48h后进行实验分组。浓度梯度组：分别加入终浓度为 0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10μmol/L的鱼藤酮处理细胞12h。时间梯度组：加入终浓度为1μmol/L的鱼藤酮，分别处理0、2、6、12、18、24h。鱼藤酮处理完后，吸去培养基，PBS洗涤3次，冰甲醇－20℃，固定15min，PBS洗涤3次，封片，利用荧光显微镜观察照相。细胞自噬水平采用GFP－LC3荧光斑点计数法，即对每个细胞中的GFP－LC3荧光斑点数目进行计数，每组样品随机统计200个细胞。

1.2.3 透射电镜观察细胞结构 取对数生长期的PC12细胞，按照3×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，加入终浓度为1μmol/L的鱼藤酮，分别处理0、2、6、12、18、24h。收集各组细胞，放于10mL离心管中，800 g，离心半径14.5cm，离心15min，弃去上清液。沿管壁缓慢加入4mL 0.5%戊二醛固定液，于4℃静置10～15min，再于10 000 g，离心半径10.45cm，离心10min，弃去上清液。沿管壁缓慢加入4mL 3%戊二醛固定液进行预固定，1%四氧化锇再固定。丙酮逐级脱水，Epon812包埋，半薄切片进行光学定位，超薄切片后进行醋酸铀和枸橼酸铅双染色，日立H－600型透射电镜观察。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件处理数据，定量资料以均数±标准差（±s）描述，组间比较采用单因素方差分析（one－way ANOVA）。检验水准α设定为0.05。

2 结果

2.1 荧光显微镜观察各浓度梯度组细胞中GFPLC3荧光斑点

使用荧光显微镜观察各组细胞中GFP－LC3荧光斑点情况，结果显示，随着鱼藤酮浓度升高，PC12细胞中GFP－LC3荧光斑点的数量也随之上升，并且从1μmol/L浓度的鱼藤酮处理开始，PC12细胞的形态也产生明显的收缩、变圆等变化（图1～2）。

2.2 Western blot检测各浓度梯度组细胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ表达

利用Western blot检测各组细胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ的表达情况，结果表明，随着鱼藤酮浓度的升高，PC12细胞中LC3－Ⅱ的表达呈增长趋势，进一步分析结果显示，随着鱼藤酮浓度梯度的增加，衡量细胞自噬水平的LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值也呈梯度增长趋势（图3～4）。

图1 细胞荧光技术检测各组细胞中GFP－LC3荧光斑点

图2 各组细胞中GFP－LC3荧光斑点数量（±s）

图3 Western blot检测各组细胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ的表达

图4 各组细胞中LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ表达

2.3 荧光显微镜观察各时间梯度组细胞中GFPLC3荧光斑点

使用荧光显微镜观察各组细胞中GFP－LC3荧光斑点情况，结果显示，随着鱼藤酮处理时间的延长，细胞中GFP－LC3荧光斑点的数量也随之上升，并且鱼藤酮处理6h后，PC12细胞的形态也产生了收缩、变圆等变化（图5～6）。

图5 细胞荧光技术检测各组细胞中GFP－LC3荧光斑点

图6 各组细胞中GFP－LC3荧光斑点数量（±s）

2.4 Western blot检测各时间梯度组细胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ表达

利用Western blot检测各组细胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ的表达情况，结果表明，随着鱼藤酮处理时间的延长，PC12细胞中LC3－Ⅱ的表达呈先增高后降低的趋势，进一步的分析结果显示，随着处理时间的增加，衡量细胞自噬水平的LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值也呈先增高后降低的趋势（图7～8）。

图7 Western blot检测各组细胞中LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ的表达

图8 各组细胞中LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ表达

图9 电镜观察1μmol/L鱼藤酮处理对PC12细胞自噬影响（×1 2000）

2.5 透射电镜观察各时间梯度组细胞显微结构

采用透射电镜观察1μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞后，细胞自噬随时间变化的情况，发现2h细胞内即可观察到部分线粒体发生明显肿胀；6h和12 h细胞内均有明显增多的自噬体和自噬溶酶体，并且线粒体数量明显减少；18h和24h多数细胞均有核浓缩变小，细胞内充满液泡样结构，同时多数细胞死亡脱落（图9）。

3 讨论

LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值法和LC3荧光斑点计数是广泛用于细胞自噬水平检测的两种方法，本研究主要采用这两种方法研究鱼藤酮处理对PC12细胞自噬水平的影响。结果显示，随着鱼藤酮处理浓度的升高，各组细胞中LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值和LC3荧光斑点数量均呈上升趋势，表明鱼藤酮处理浓度与细胞自噬水平有较大的相关性。同时，鱼藤酮处理浓度由0.5μmol/L增加为1μmol/L时，PC12细胞形态发生显著改变，如细胞突触明显减少、多数细胞收缩变圆等。已有研究［8－11］证实，细胞形态改变是细胞发生大量自噬导致的细胞主要变化之一，表明1μmol/L鱼藤酮处理可以诱导PC12细胞发生明显自噬。因此，选择1μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞进行后续的时间梯度实验。

在时间梯度实验中，随着鱼藤酮处理时间延长，PC12细胞中LC3荧光斑点数量也随之增加，二者表现出较好的一致性。但是，各组细胞中的LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值，在0～6h处理时间段内增高，而在6～24h处理时间段内却降低。已有研究［12－14］表明，在神经细胞中，LC3－Ⅰ的含量明显高于LC3－Ⅱ，这与LC3－Ⅱ在自噬的发生过程中很快被清除有关，并且在自噬的发生过程中，LC3－Ⅰ会转化成LC3－Ⅱ，因此，可以用LC3－Ⅰ的变化来说明自噬的程度。本实验结果也表明，从6h开始细胞内LC3－Ⅰ的含量在逐渐降低，并在24h达到最低值，表明从6h开始LC3－Ⅰ转化成LC3－Ⅱ的速度增快，使得LC3－Ⅰ的生成速度低于LC3－Ⅰ的转化速度，从另一方面也揭示此时细胞的自噬水平在增加。

为了进一步揭示鱼藤酮处理时间对PC12细胞自噬的影响，本研究采用透射电镜观察细胞超微结构的改变。随着鱼藤酮处理时间延长，PC12细胞中的线粒体首先发生肿胀等异常改变，同时细胞内的自噬体和自噬溶酶体也随之增加，而经过长时间（18h后）的处理，多数细胞内充满液泡样结构，同时细胞死亡脱落，这一过程类似于细胞自噬性死亡，但还需要进一步的实验证实。

综上所述，鱼藤酮处理浓度和处理时间与PC12细胞的自噬水平存在一定的相关性，并且1μmol/L鱼藤酮处理6h，即可诱导PC12细胞形态发生明显改变。而电镜观察结果表明，鱼藤酮处理会导致细胞线粒体损伤，从而诱导PC12细胞自噬的发生。

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