EpiSkin皮肤模型应用概述

王晓娜 王晓梅 杨素珍

(山东福瑞达生物工程有限公司 山东济南 250101)

1 背景介绍

欧洲替代方法验证中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM)的创立是以保护动物在试验和其他科学研究方面的使用为目的,发展审批有助于缩减、优化、替代(Reduce, Refine, Replace, 3Rs)动物试验的替代方法[1-2]。

人类提出组织工程概念,以正常人体皮肤生理结构和功能为理论基础,基于组织工程原理和技术构建的皮肤替代物称为组织工程皮肤,其具有和皮肤相同结构,有表皮,真皮和全层组织[3]。

根据ECVAM科学咨询委员会(ECVAM Scientific Advisory Committee,ESAC)发布公告,EpiSkin(L’Oreal)、EpiDerm(ZEBET)和SkinEthic这3种组织工程皮肤先后在1998年3月、2000年3月和2006年11月通过了验证工作。这3种皮肤模型能够根据OECD TG 431操作指南来区分腐蚀性和非腐蚀性化合物,可以将其作为皮肤腐蚀性化合物检测的动物替代方法[4-6]。ECVAM在2003年资助并启动了旨在替代传统Draize皮肤刺激性检测(EU Annex V B.4;OECD TG 404)的正式皮肤刺激性验证研究。正式皮肤刺激性研究分两期完成,第一期分别使用EpiDerm,Episkin和SIFT(Skin Integrity Function Teat,Syngenta),以MTT法检测细胞存活率。经试验检测发现EpiDerm,Episkin能够满足检测要求[7]。在2007年4月公布了EpiSkin作为Draize皮肤刺激检测的替代方法。2014年9月欧莱雅在中国获得人体皮肤重建模型EpiSkin的营业执照,开启了组织工程在中国的研究与应用。

2 EpiSkin皮肤模型简介

EpiSkin皮肤模型模拟人天然皮肤结构,将分离的人表皮细胞接种在特定的生物材料上进行培养,形成具有三维结构的人表皮样皮肤模型。

在中国生产的EpiSkin表皮模型是取自于中国成年人志愿者的阴茎包皮角质形成细胞,这些志愿者都经过血清检测确保不携带HIV 1型、HIV 2型、乙肝和丙肝病毒。角质形成细胞被培养在含有Ⅰ型和Ⅳ型胶原的拟真皮替代物上[8]。经过体外培养和增殖,表皮模型可以获得高分化的分层的表皮,并且基于气液双相的胶原介质上。该表皮模型由基底层、基底上层、棘层、颗粒层和具备屏障功能的角质层组成。免疫组织化学检测显示表皮成熟特异性标记 profilaggrin、CK1/K10、involucrin 和I型表皮转谷氨酰胺酶的表达;超微结构分析显示存在透明角质蛋白颗粒、张力丝、桥粒等结构。

“EpiSkin”模型试剂盒( 中国生产)由12个表皮模型单位(单位表面积0.38cm2) 、维持培养基和测试培养基共同组成的。这种皮肤模型在皮肤刺激性测试的使用中包括两方面,一方面是将测试样品局部滴旋到皮肤模型表面,另一方面是对这些测试样品对细胞活性的影响进行后续评估。

欧莱雅的首席科学家Patricia Pineau指出,为了验证这种人造皮肤的有效性,研究人员还需要证实该方法能够像动物检测一样有效。独立的检测证实,在一些情况下,Episkin能够比动物检测方法更精确地预测一个人是否会对产品起反应。

3 国内研究使用现状

Episkin这种皮肤模型在皮肤刺激性测试的使用中包括两方面,一方面是将测试样品局部滴旋到皮肤模型表面,另一方面是对这些测试样品对细胞活性的影响进行后续评估。北京出入境检验检疫局采用“EpiSkin”3D 人工皮肤模型,按照欧盟 OECD 439 推荐使用的 20 种用于皮肤模型刺激性测试的化学品,同时遵循OECD 439的实验流程进行皮肤模型的化妆品刺激性测试,并根据其判断标准来预测化学品对于皮肤的刺激性。采用MTT 方法定量细胞活力,以相对细胞活力值为标准,与 ECVAM 体内测试分类结果相比较,能正确判定所选 10 种刺激性化学品中的 9 种,灵敏度达到 90%;能正确判定 10 种非刺激性化合物中的 7 种,该皮肤模型特异性为 70%。和被欧盟认可的 EpiSkin 皮肤模型在欧洲的评价结果相一致。得出结论3D人工皮肤模型“EpiSkin”可以评估化学品的皮肤刺激性[9]。

4 操作方法

4.1 皮肤腐蚀性体外试验

将EpiskinTM模型与受试物接触4～6h,液体受试物可直接均匀涂在皮肤模型上,固体受试物先将受试物研磨成粉末均匀铺在皮肤模型上,加入少许NaCl溶液使受试物与皮肤模型接触良好,然后用PBS漂洗干净;用噻唑蓝(MTT)法检测受试物对细胞存活率的影响:将皮肤模型放入20～28℃的MTT溶液中作用3h,然后提取蓝紫色沉淀物,在545nm或595nm波长处测量该沉淀物的光密度。

实验分别采用NaCl和冰醋酸作阴性和阳性对照。阴性对照的光密度值设定为100%细胞存活率,根据以下公式计算受试物组的细胞存活率。

如果受试物组细胞存活率≤35%,则评定该受试物具有腐蚀性。根据“将细胞存活率降到35%以下所需的暴露时间”对受试物进行腐蚀性分级。EpiSkinTM法在实验室内和实验室间的比对试验结果重现性很好,可以测试各种不同理化特性的物质。

4.2 皮肤刺激性体外试验

将受试物(10μL/mg)涂抹在EpiSkinTM皮肤模型上,18h后用MTT法测试细胞存活率,如果细胞存活率≤50%,则该受试物具有刺激性。

5 结语

欧盟自2009年3月起将禁止利用动物进行化妆品的测试,也不允许其成员国进口经动物实验检验的产品。按照“4R”原则,发展快速、高效、敏感的毒理学安全性评价替代方法成为主要的发展趋势和近几年国际上的研究热点之一。我国是化妆品生产和使用大国,建立能与国际接轨的化妆品替代实验方法具有非常的迫切性。EpiSkin皮肤模型的成功建立在很大程度上解决了这个难题,在化妆品及原料的检测中发挥了重要作用,其必在今后化妆品产业中占有重要位置。

[1]Balls M. ECVAM and the promotion of international cooperation in the development, validation and acceptance of replacement alternative test methods[J]. Altex, 1999, 16:280-282.

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[8]邹运动.含有表皮层、真皮层和皮下脂肪层结构组织工程皮肤的构建[M].西北农林科技大学,2008.

[9]马丹,赵晓娟,付溥博 等.3D人工皮肤模型用于化学品皮肤刺激性实验的评估[J].卫生研究,2014,43(1):149-151.