米口袋不同萃取部位体外抑菌活性研究

韩毅丽，张娟娟，张淑蓉

（山西中医学院，山西太原 030024）

米口袋（Gueldenstaedtia multiflora Bge.）是豆科米口袋属植物，主要分布于我国东北、华北及陕西、甘肃等省区，全草及根做“地丁”入药，陕西关中地区做“紫花地丁”用，有清热解毒、凉血消肿的功效，临床可用于治疗咽炎、乳腺炎、目赤肿痛等病症［1］。近年来，对米口袋药理活性的研究正逐渐兴起，多项研究结果显示，米口袋具有抗菌消炎、清除自由基及抗氧化、兴奋子宫、镇痛、增强免疫功能等药理作用［2-5］。但未见对米口袋不同溶媒萃取部位抗菌消炎作用研究的详细报道，其抗菌消炎的有效部位尚未确定。因此，本实验利用体外抑菌实验，通过药敏纸片法测定米口袋不同溶媒萃取部位对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念珠菌和肺炎链球菌四种引起炎症的常规致病菌的抑菌圈直径，初步确定米口袋抗菌消炎的有效部位，为米口袋活性成分的提取分离及新的抗菌药物的开发研究奠定基础。

1 实验材料

1.1 试药

米口袋全草购自河北安国冷背药材市场，并由山西中医学院中药鉴定教研室王兵老师鉴定。

95%乙醇、石油醚（60℃～90℃）、氯仿（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯，购自天津市光复科技发展有限公司；正丁醇（分析纯，天津市进丰化工有限公司）、Mueller-Hinton琼脂（编号HB62323，青岛高科园海博生物技术有限公司）、NaOH（分析纯）、蛋白胨（北京博兴生物技术有限公司）、氯化钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心）、牛肉膏（批号：20131218，北京博兴生物技术有限公司）。

金黄色葡萄球菌（山西生物应用职业技术学院微生物实验室提供），枯草杆菌（山西医科大学第一医院提供），肺炎链球菌（编号：GIM1550，广东省微生物菌种中心），白色念珠菌（白色假丝酵母，编号：GIM2.169，广东微生物菌种中心）。

1.2 仪器

真空水浴泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）、超声提取器、双圈定性滤纸（杭州沃华滤纸有限公司）、Finnpipette单道移液器、TH-8D空气恒温振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、BBSDDL超净工作台、LMQ·R-32608立式灭菌器、DHP-9162电热恒温培养箱、JA2603B电子天平。

2 方法与结果

2.1 不同萃取部位的制备

2.1.1 水煎液及不同萃取部位的制备 取米口袋药材 100g，加水 1200mL浸泡 1h，再煎煮 2.5h，过滤；第2次加水800mL煎煮2h，过滤；第3次加水800mL煎煮1.5h，过滤，合并滤液，经减压抽滤后，挥干溶剂称重，置于干燥器中备用。

按上述方法制备米口袋水煎液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并各萃取液，将各萃取液及萃取后的剩余水提液挥干溶剂后称重，置于干燥器中备用［6］。

2.1.2 醇浸液及不同萃取部位的制备 取米口袋药材100g，加65%乙醇700mL，浸渍7d后过滤，再经减压抽滤后回收溶剂，转移至蒸发皿中，挥干溶剂后称重，置于干燥器中备用。

按上述方法制备米口袋醇浸液总浸膏后，加60mL石油醚，超声萃取50min，静置20min，分离萃取液，连续提取3次，合并石油醚萃取液并挥干溶剂后称重，置于干燥器中备用。按照石油醚萃取步骤再依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到不同萃取部位及剩余药液浸膏。

2.2 各菌不同浓度菌悬液的制备

2.2.1 供试菌株的制备 准确称取牛肉膏3g，加1000mL蒸馏水适量使充分溶解，后加入蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂33g和剩余的蒸馏水，待完全溶解后，121℃灭菌20min，趁热倒入已灭菌的试管中，将试管加棉塞后倾斜放置使培养基铺满试管壁，待完全凝固后，将供试的细菌菌种用无菌接种环划线移接到相应的试管斜面固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养 24h，冷藏备用［7-9］。

2.2.2 液体培养基的制备 准确称取牛肉膏1.5g，加500mL蒸馏水适量，加热搅拌至充分溶解，后加入蛋白胨5g，氯化钠2.5g及剩余的蒸馏水。待完全溶解后，用1%NaOH溶液调节pH为7.2～7.4，再于121℃灭菌20min，取出后分装到各个已灭菌的试管中备用［7-9］。

2.2.3 不同浓度菌悬液的制备 从试管斜面固体培养基上挑取一个菌落，放入盛有5mL液体培养基的试管中，轻轻晃动试管，放入摇床内37℃摇动培养24h，吸取1000μL，放入盛有9mL液体培养基的试管中，用迷你振荡器充分摇匀，再吸取该菌悬液1000μL置于另一盛有9mL无菌液体培养基的试管中，混匀，连续操作5次，分别得到稀释倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的菌悬液备用［7-9］。

2.3 菌悬液最佳稀释倍数的确定

吸取200μL各类菌不同稀释倍数的菌悬液，置于铺好的平板中央，均匀涂布菌悬液，静置5min，37℃培养24h，观察各类菌的菌落生长情况，以菌落密集、轻薄、均匀生长为佳，从而确定各类菌菌悬液的最佳稀释倍数［7-9］，结果见表 1。

表1 各菌菌悬液最佳稀释倍数

2.4 最佳抑菌药量的确定

用0.2g/mL的米口袋水提物制成含药量分别为 6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg的药敏片，以蒸馏水药敏片为阴性对照，按顺序放入最佳浓度菌悬液中，37℃培养24h，采用十字交叉法测定抑菌圈直径［7-9］，确定了不同菌的最佳抑菌药量分别为：金黄色葡萄球菌10mg，枯草杆菌、白色念珠菌及肺炎链球菌均为12mg，结果见表2。

表2 不同药量对各类菌的抑菌直径 （mm）

2.5 体外抑菌效果的测定

将不同萃取部位制备成0.2g/mL的药液，根据K-B药敏纸片扩散法［10］，按照最佳抑菌药量制作成相应的药敏纸片，并放入按最佳稀释倍数制备好的各菌菌悬液中，贴于培养基表面，以相应的溶剂空白作为阴性对照，待药敏片完全吸附后，37℃培养箱中倒置培养24h，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，平行实验2次，结果见表3。

表3 不同萃取部位对各菌的抑菌圈直径 （mm）

根据药物实验敏感判定标准（见表4）及各部位抑菌圈直径可见：米口袋不同萃取部位对4种菌的抑菌活性不同，米口袋水煎液石油醚萃取部位对金黄色葡萄球菌达到了中度敏感；米口袋水煎液石油醚、氯仿萃取部位及65%醇浸液乙酸乙酯萃取部位对枯草杆菌达到了中度敏感；米口袋65%醇浸液石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取部位对肺炎链球菌达到了中度敏感。水煎液石油醚萃取部位对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念珠菌的抑菌效果均略大于水煎液氯仿部位，而65%醇浸液氯仿萃取部位对肺炎链球菌的抑菌效果最强。米口袋65%醇浸液氯仿萃取部位对肺炎链球菌的抑菌活性要强于水煎液氯仿萃取部位对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及白色念珠菌的抑菌活性。

表4 药物敏感实验判定标准

3 讨 论

通过实验发现米口袋对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念珠菌、肺炎链球菌的抑菌活性均能达到中度敏感，说明米口袋对这4种菌有较强的抑制作用。并且，米口袋不同萃取部位对不同菌的抑菌活性不同，所以米口袋的抗菌效果及能否作为一种常规中药还有待进一步的研究开发。此外，根据抗菌药物需达到中度敏感的要求和抑菌圈直径可以看出米口袋抗菌消炎功能的有效部位主要是米口袋水煎液的石油醚、氯仿部位及65%醇浸液的石油醚、氯仿和乙酸乙酯部位。

米口袋抗菌消炎有效部位的研究将为米口袋药效的提高和新的抗菌药物的开发提供进一步的研究依据。

［1］韩毅丽，高黎明，魏太宝.米口袋挥发油化学成分研究［J］.山西中医学院学报，2010，11（1）：18-20.

［2］王军宪，朱蓉.米口袋的化学成分研究［J］.西北植物学报，1989，9（2）：127-130.

［3］黄海兰，徐波.米口袋抗食用油脂氧化活性及其成分研究［J］.食品科学，2006，27（11）：93-96.

［4］朱蓉，朱大元，徐任生，等.地丁化学成分的研究［J］.中草药，1984，15（8）：1.

［5］刘红燕.甜地丁生药学研究［D］.济南：山东中医药大学，2009.

［6］韩毅丽，高黎明.米口袋化学成分的研究［J］.山西中医学院学报，2009，10（5）：24-25，66.

［7］中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程（第三版）［M］.南京：东南大学出版社，1997：556-561.

［8］尚彩玲，都华伟，薛慧清.青翘正丁醇部位的抑菌研究［J］.山西中医学院学报，2013，14（1）：35-38.

［9］徐威.微生物学实验［M］.北京：中国医药科技出版社，2004：40.

［10］路福平.微生物学［M］.北京：中国轻工业出版社，1988：14-16.