差示分光光度法测定独一味胶囊中总黄酮含量

郭爱玲，张淑蓉，刘晓芳，李 虹，焦建华，裴晓丽

（山西中医学院，山西太原 030024）

独一味 Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo 为唇形科独一味属仅有的一种植物，是藏、蒙、纳西等少数民族常用草药［1］。以独一味开发出的国家新药独一味胶囊，收载于《中国药典》2010年版一部，具有活血止痛、化瘀止血的功效。临床上用于多种外科手术后的刀口疼痛、出血，外伤骨折，筋骨扭伤，风湿痹痛以及崩漏、痛经、牙龈肿痛、出血等病症的治疗［2］。总黄酮是独一味胶囊的主要有效成分之一，具有多方面生理活性，常作为药效学和质量控制指标。本文采用差示分光光度法测定该制剂中的总黄酮，操作简便、结果准确、重现性好，不需分离即可直接用于测定，减少了干扰组分对测定的影响，可为独一味胶囊的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

UV-1600紫外分光光度计（北京瑞利公司）。芦丁对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：100080-200707，含量测定用）；独一味胶囊（甘肃独一味生物制药股份有限公司，批号：0709032004，0902024323，0910032327）；氯化铝、亚硝酸钠、二氯氧锆、乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、甲醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取19.56mg芦丁对照品加入25mL 60%乙醇中，水浴加热溶解，冷却，在100mL容量瓶中用60%乙醇定容，摇匀，得0.1956mg/mL对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

在50mL锥形瓶中，精密称定研细的独一味胶囊内容物0.6g，加60%乙醇20mL，超声提取30min，连续提取3次，合并提取物，在100mL容量瓶中用60%乙醇定容，静置过夜，测定时精密量取上清液。

2.3 测定波长的选择

精密量取0.8mL对照品溶液2份，分别置于10mL容量瓶中，其中1份加5mL氢氧化钠试液，再加水到刻度，作为碱性空白；另1份加0.2mL 5%NaNO3溶液，混匀，放置 6min，加 0.5mL 2.5%AlCl3溶液，摇匀，放置6min，加5mL氢氧化钠试液，再加水到刻度，摇匀，放置40min。在波长400nm～700nm范围内扫描测定，观察到517nm处差示吸光度值最大。另取0.2mL供试品溶液2份，根据以上方法，观察供试样品络合前后差示吸收光谱的变化，发现供试品溶液与对照品络合前后的差示吸收光谱基本一致，在517nm处有较大的差示吸光度值，因此将517nm作为测定波长。

2.4 标准曲线的制备

在10mL容量瓶中，分别移取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL 对照品溶液各2份，其中1份加5mL氢氧化钠试液，并用水定容作为参比液；另1份依次加0.2mL 5%NaNO3溶液，混匀，放置 6min，加 0.5mL 2.5%AlCl3溶液，混匀，放置6min，加5mL氢氧化钠试液，用水定容，摇匀，放置40min。分别于517nm处测定不同浓度溶液络合前后吸光度的差值△A。以△A与对照品溶液的浓度C作回归分析，可得回归方程：△A=9.6375C+0.0017，r=0.9997。说明芦丁在9.78μg/mL～68.46μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。

2.5 稳定性实验

加入络合剂后的供试品溶液在室温下放置不同时间，于517nm测定络合前后吸光度的差值，结果显示，40min内络合反应达到平衡，在1h内显色比较稳定。

2.6 精密度实验

精密移取2份1.0mL供试品溶液，按2.4项方法连续测定吸光度值6次，测得RSD为0.07%，说明该方法精密度良好。

2.7 重复性试验

对同一批样品制备6份供试品溶液，分别精密移取1.0mL供试样品溶液，按2.4项方法操作测定，计算总黄酮含量，RSD为2.7%，说明该方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验

在10mL容量瓶中，精密移取已知含量的供试样品溶液若干份，分别加入适量的芦丁对照品溶液，按2.4项方法测定，计算回收率，平均回收率是100.31%，RSD 为 2.13%（n=6），结果见表 1。

2.9 样品含量测定

分别精密移取1.0mL不同批号的样品溶液各2份，按2.4项方法操作，在517nm处测定各样品溶液的差示吸光度值△A，各样品溶液平行测定3次，取平均值，代入标准曲线方程，计算各样品中总黄酮的含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验 （n=6）

表2 不同批号的样品总黄酮含量 （n=3）

3 讨 论

3.1 提取方法和溶媒的选择

本实验选择比较了5种不同溶剂即甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇超声提取30min和水浴提取30min的提取效率，结果表明超声提取率高于水浴提取率，乙醇提取率高于甲醇提取率，50%～60%乙醇提取效果较好，但50%乙醇提取液不容易澄清。因此，确定以60%乙醇进行超声提取，既保证测定溶液的澄清，又符合含量测定的需要。

3.2 显色剂的选择

参照文献［3-5］和《中国药典》（2010版一部），对 2%ZrOCl2·8H2O 溶液、2.5%AlCl3溶液和 5%NaNO2-2.5%AlCl3-NaOH试液混合体系3种显色剂分别进行了探讨。结果表明5%NaNO3-2.5%AlCl3-NaOH试液显色体系准确度和灵敏度最高。故本实验采用此显色剂。另外对5%NaNO3溶液、2.5%AlCl3溶液和NaOH试液的加入量进行了考察，结果表明，以加入5%NaNO3溶液0.2mL、2.5%AlCl3溶液0.5mL和NaOH试液5mL为最佳试剂加入量。

通过独一味胶囊中总黄酮超声提取及含量测定方法的加样回收率、重现性、稳定性等实验，表明该方法简单、可靠，可用于独一味胶囊中总黄酮的含量测定，并为其生产质量控制方法提供一定的参考意义。

［1］吴征镒.西藏植物志（第四卷）［M］.北京：科学出版社，1985：158.

［2］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：939-940.

［3］彭燕，王本富，苗爱东，等.差示分光光度法测定白花蛇舌草注射液中总黄酮的含量［J］.华西药学杂志，2008，23（1）：109-110.

［4］薛淑萍，张立伟.大孔吸附树脂提取、分离桑叶总黄酮的条件优化［J］.山西中医学院学报，2006，7（1）：51-52.

［5］龚燕波，方崇波.差示分光光度法测定复方刺梨合剂中总黄酮的含量［J］.海峡药学，2008，20（11）：46-48.