球孢白僵菌在玉米中的定殖研究*

魏世誉，王 娟，隋 丽，李启云，张正坤，张佳诗，路 杨，赵 宇，张延明，徐文静＊＊

(1．哈尔滨师范大学;2．吉林省农业科学院;3．东北农业大学)

0 引言

玉米是世界上分布最广泛的粮食作物之一，其种植面积仅次于小麦和水稻．玉米的用途十分广泛，可作为人们廉价的裹腹之物，也可作为饲料以及工业原料，其中饲料消费是玉米最重要的消费渠道，约占消费总量的70%左右，工业原料使用也是玉米消费的主要渠道．因此，其产量的高低直接关系到国家粮食生产安全和农民经济收入，但是，由于多年重茬种植及全球气候变化异常等因素的影响，导致害虫在玉米田间的危害更加严重．玉米螟是我国玉米生产中最突出的害虫之一，它可在玉米的不同生育期进行危害，降低玉米的产量和品质，严重制约了玉米产业的发展．

近年来随着对白僵菌生态习性的研究，发现其部分种类属于植物内生菌，并在植物的促生抗虫中发挥了重要的作用．

1 白僵菌的生物学特性与致病机理

白僵菌是一种虫生真菌，属半知菌亚门(Deteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomy-cetales)、丛梗孢科(Moniliaceac)、白僵菌属(Beauveria)［1］．其中球孢白僵菌和卵孢白僵菌隶属白僵菌属，常被用于生物防治．该实验以球孢白僵菌为实验菌株．球孢白僵菌的杀虫机理不同于化学杀虫剂．球孢白僵菌是将分生孢子以粉状或雾状的形态与虫体相接触，经昆虫呼吸系统和消化系统直接进入虫体，在适宜的温湿度条件下孢子萌发芽管，其分泌的几丁质酶可溶解害虫体表的几丁质，破坏虫体保护屏障．同时球孢白僵菌吸收虫体营养，并产生毒素，最终致使虫体死亡［2］．

2 球孢白僵菌防治玉米螟的应用现状

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)防治玉米螟(Osirinia furnacalis)的效果早已得到肯定，但施菌技术限制着球孢白僵菌在田间的推广及应用［3］，尤其是在剂型选择方面．颗粒剂可对玉米心叶定向施药，针对性强;悬乳剂和油悬剂的可操作性强，毒力测定效果好于颗粒剂，但在田间采用喷雾器施药时，无法准确定位虫体所在部位，药效会有所降低;粉剂喷粉功效虽高，但粉尘污染较严重［4］．该研究利用球孢白僵菌的植物内生性，将其定殖在玉米中，旨在明确球孢白僵菌同其他生防菌相比是否具有更加明显的优势，同时也将为多渠道开发利用球孢白僵菌提供新的科学数据．

3 材料与方法

3．1 材料

(1)供试菌粉、种子及土壤

供试菌株为球孢白僵菌高孢粉，从吉林省农院生物制剂厂采购，含孢量≥1000亿孢子/g，孢子萌发率≥90%，含水量5% ～10%．

供试种子为垦粘1号玉米，从吉林省公主岭市种子市场采购．

土壤取自吉林省农业科学院内菜园土，去除石子和杂草后过筛．

(2)培养基及其成分

PPDA筛选培养基:马铃薯200 g、葡萄糖10 g、琼脂 9 g、蛋白胨 5 g、去离子水 1000 mL、125 mg/L头孢霉素、138 mg/L硫酸卡纳霉素、70 mg/L多果定．

3．2 方法

(1)孢子悬液的制备

取1 g球孢白僵菌高孢粉加入100 mL含0．1%的Tween-80无菌水中，用玻璃珠在摇床上震荡打散，稀释100倍，显微镜下计算孢子浓度，并把孢子悬液原液稀释至1×108个/mL，以此孢子悬液的浓度为初始浓度，依次稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，制得 1×104、1×105、1×106、1×107、1×108这5个浓度梯度的孢子悬液．

计算公式如下:孢子数/mL=A/5×25×10×1000×B=50000×A×B，式中:A:计数室四个角上的四个格和中间的一个格共计五个中格的微生物细胞数和;25:25个中格;B:样液稀释倍数:10、1000:单位换算倍数［5］．

(2)玉米种植

种子筛选:将从种子市场采购的垦粘1号玉米种子经过细心筛选，去除生虫，干瘪的不良个体，选出颜色，饱满度，体积大小等生物量相近的健康玉米种子，共计选取180粒．分组:将这180粒垦粘1号玉米种子分为6个组，每组30粒，3个重复，每个重复10粒．播种和管理:准备180个口径20 cm，高15 cm的小塑盆，每盆装3 kg供试土壤，然后将选好的种子放入土下约8 cm处，每盆种一粒种子，种子种完后，每盆浇100 mL水，之后按常规措施管理．

(3)玉米灌根

第一次灌根:玉米长到3叶-4叶幼苗期，测量每株玉米株高，之后进行第一次灌根，每株100 mL，标准见表1．

表1 灌根标准

第二次灌根:第一次灌根15 d后，测量每株玉米株高之后进行第二次灌根，灌根标准同表1．

(4)球孢白僵菌在玉米叶片中的定殖检测

第二次灌根两周后开始做球孢白僵菌在玉米叶片内的定殖检测．步骤如下:

取叶片:每个处理随机选取10株玉米，取从心叶起向外数的第3片叶片，用剪刀剪取面积约25 cm2的叶片，每株取一片，按编号分开装入写好标号的小塑料自封袋中．

洗叶片:先将取的玉米叶片在实验室内用自来水冲洗干净后再用灭菌水反复冲洗，彻底去除泥土之后，将叶片拿入在超净工作台内，进行再清洗，依次经过3%次氯酸钠消3 min，70%的酒精消毒3 min，最后用无菌水清洗3 min．

剪叶片:在超净工作台内经过三次清洗后，将叶片用已灭菌镊子夹到已灭菌的含有滤纸的培养皿中，用滤纸吸干叶片表面多余的水分，之后用镊子把叶片夹在酒精灯火焰附近，用已灭菌的剪刀的首先剪去玉米叶片边缘部分，然后将剩余的叶片剪成0．5 mm左右的小正方形．

接种:用已灭菌的镊子将这些小正方形接种入已经制备好的含有70 mg/L的多果定，125 mg/L头孢霉素，138 mg/L硫酸卡纳霉素的PPDA最适筛选培养基［6］上，每皿9片，之后用封口膜封口，拿出超净工作台，放入培养箱25℃培养，72 h后逐日观察记录球孢白僵菌在植物叶片内的定殖情况．

球孢白僵菌在玉米叶片定殖率的计算公式如下:

定殖率=球孢白僵菌定殖的玉米株数∕试验总株数

(5)球孢白僵菌对玉米的促生作用

用玉米的生长速率来表明球孢白僵菌对玉米的促生作用，计算公式如下:

平均生长速率=第二次测的株高-第一次测的株高∕两次测株高间隔的天数(cm/d)

(6)玉米抗虫性的鉴定与调查

调查方法:在玉米生长的喇叭口期对种植的180株玉米逐株调查中上部叶片被玉米螟取食情况，按组分开做好数据记录，根据玉米螟幼虫取食心叶后所形成的叶片虫孔直径大小和数量划分食叶级别，标准见表2．

表2 玉米螟取食调查标准

抗性评价:将测得的数据与《中华人民共和国农业行业标准玉米抗病虫性鉴定技术规范》第5部分玉米抗玉米螟鉴定技术规范标准［7］进行比对，进而评判玉米对玉米螟虫害反应程度和抵抗水平，标准见表3．

表3 虫害级别标准

玉米螟对每组玉米叶片食叶级别的平均值的计算方法如下:

平均食叶级别=∑(食叶级别×该级别株数)∕调查总数

4 结果与分析

4．1 球孢白僵菌在玉米叶片的定殖检测

经由Excel软件处理观察记录的数据，结果表明，用不同浓度菌悬液灌根的玉米，球孢白僵菌在玉米叶片的定殖率不同，孢子浓度在104到107之间时，孢子浓度越大定殖率越高，超过107这个浓度后，定殖率增加不明显．1×104、1×105、1 ×106、1 ×107、1 ×108这5 个浓度的定殖率依次为 12%、13．5%、15．4%、16%、16．5%(如图1所示)．

图1 球孢白僵菌在玉米叶片中的定殖率

PPDA筛选培养基中球孢白僵菌在玉米叶片内的的定殖结果如图2所示:用孢子悬液灌根的玉米叶片在PPDA筛选培养基中培养的第三天，叶片周围长出白色可见的球孢白僵菌，如图2(a)所示;用孢子悬液灌根的玉米叶片在PPDA筛选培养基中培养的第八天，叶片周围长出的球孢白僵菌菌落已基本形成，如图2(b)所示．说明球孢白僵菌在玉米叶片中有定殖，并且球孢白僵菌在这个浓度的PPDA筛选培养基上生长良好．

4．2 球孢白僵菌对玉米的促生作用的测定

灌根前后检测的每组玉米的株高，数据统计结果表明，灌等量的水的第1组为对照组，生长速率为0．221 cm/d，不同浓度的菌液灌根后的玉米的生长速率不同，其中在第5组孢子浓度为107时对玉米生长速率有最大提高量为0．403 cm/d，如图3所示，相对于对照组生长速率提高量为0．182 cm/d，之后增加孢子浓度，球孢白僵菌对玉米的促生效果增加不明显．

图2 叶片在PPDA筛选培养基中的定殖

图3 球孢白僵菌菌灌根后玉米生长速率的变化

4．3 玉米抗虫性的测定

每组每株玉米叶片的食叶级别检测结果表明，球孢白僵菌菌悬液灌根的玉米心叶期食叶级别平均值集中在3．0～6．9之间，虫害级别为3～5级，抗性为抗或中抗，如图4所示．未用菌悬液灌根的玉米玉米心叶期食叶级别平均值为9．0，虫害级别为9级，抗性为易感，因此，球孢白僵菌孢子悬液灌根玉米能很好的提高玉米的抗虫性．

图4 球孢白僵菌菌孢子悬液灌根玉米后玉米抗虫性的变化

5 结论

不同孢子浓度的菌悬液对玉米灌根，孢子浓度在104到107间时，球孢白僵菌在玉米中的定殖率，对玉米的促生作用和抗虫作用都增加明显，超过107这个浓度后增加不明显，最适浓度为107．因此，球孢白僵菌能在玉米中定殖，并对玉米有良好的促生和抗虫作用的绿色生防菌，具有广泛的应用前景．

6 讨论

球孢白僵菌等微生物制剂的广泛应用与发展，有效地降低了化学农药的使用量和使用频率，充分发挥自然因子对田间害虫的控制力度，这正是当今全球农业发展的重要方向．就目前而言，应从种植植物的当地环境因素入手，对球孢白僵菌在植物中的定殖和玉米螟对植物的为害规律进行深入探讨，形成以种植优势植物品种为主、微生物防治为辅的综合防治体系，内外兼顾，将应用白僵菌防治玉米螟的生态优势更好地发挥出来．

［1］ 赫英伟．白僵菌的研究概况［J］．黑龙江农业科学，2010(4):145-147．

［2］ 陆晴，佘花娣，佟文悦．应用白僵菌防治玉米螟的研究进展［J］．河北农业科学，2013，17(5):59-62．

［3］ 齐永霞，陈方新．球孢白僵菌在玉米根际的定殖及对根际微生物的影响［J］．热带作物学报，2013，34(5):962-966．

［4］ 张爱文，刘维真，邓春生，等．白僵菌制剂不同剂型防止玉米螟的研究［J］．生物防治通报，1990，6(3):118-120．

［5］ 显微镜直接计数技术．http://www．docin．com/p-702396241．html．

［6］ 王韬远，徐文静，张正坤，等．球孢白僵菌分离培养基的筛选及应用［J］．中国农学通报，2013，29(9):134-138．

［7］ 农业部．玉米螟抗病虫鉴定技术规范．NY/T 1248．5-2006．