miR-20b在肾癌中的表达分析及临床意义研究

金露 李一帆 陈独群 苏郑明 刘家驹 杨尚琪 桂耀庭 毛向明 来永庆

肾细胞癌又称肾癌，约占成人恶性肿瘤的3%，是泌尿系统常见的恶性肿瘤，也是泌尿系统恶性肿瘤中致死率最高的肿瘤［1-2］。最近的肿瘤统计数据表明，在美国肾癌的发生率和死亡率均位于前十，仅2013年肾癌的新发病例就有65 150例，而且有8 780例死于肾癌［3］。肾癌发生的早期无相应的临床表现，患者多在体检或做其他疾病检查时被发现，约30%的患者因远处转移症状而就诊［4］。如果不予治疗，肾细胞癌的5年生存率约为2%，生存时间的中位数约8个月［5］。目前肾癌的发生、发展机制尚不明确，临床也尚未应用一些生物标志物来诊断、治疗肾癌或评估其预后。因此，以肾癌的发生机制为基础来寻找可用于肾癌早期诊断或靶向治疗、判断预后的生物标志物是很有必要的。

微小RNA（MicroRNA／miRNA／miR）是一种短链非编码RNA，约有22个核苷酸，miRNA能非特异性结合mRNA上的靶基因，通过使其降解或抑制其转录来调控基因的表达［6-7］。研究表明，miRNA在多个细胞进程中均扮演着重要的角色，包括细胞的增殖、分化、新陈代谢和凋亡等［7-8］。截至目前，在大量人类的癌组织中都发现了miRNA的异常表达或突变。据推测，超过60%的人类蛋白编码基因都能和miRNA结合［9］。另外，miRNA在人血清中不容易被降解而且稳定存在，容易被检测，是良好的生物标记物［10-11］。为了探究miR-20b在肾癌中的作用机制，本研究以前期测序为基础，对肾癌和癌旁组织中具有差异表达的miR-20b进行RT-qPCR验证比较，分析miR-20b的表达量是否与患者临床病理特点有关，为miR-20b在肾癌的发生发展中的作用机制以及其在肾癌中的诊断价值等后续研究奠定基础。

材料与方法

一、研究标本与临床资料

本研究随机选取42例深圳市重大疾病临床资料和生物资源标本库保存的肾癌及其配对的癌旁正常组织标本（2010年1月至2013年10月收集于安徽、北京、深圳等各大医院，每例标本均为手术切除，且均得到就诊医院和北京大学深圳医院医学伦理委员会批准，并获得患者知情同意，签署知情同意书）。每例标本包括经病理切片证实的肾癌组织及配对的癌旁正常组织（取自根治性肾切除术距离癌组织＞5cm的正常肾组织，且经病理证实无癌组织浸润）各1份，患者均有完整的临床病理资料（表1）。标本来源的肾癌患者包括女15例，男27例，平均年龄50.28（14～78）岁，中位年龄53岁。组织学分类采用WHO2004年肾细胞癌病理分类标准，临床分期则采用2009年国际抗癌组织（UICC）／美国癌症联合会（AJCC）临床分期标准。

二、主要试剂和仪器

RNA 提取试剂 Trizol（Invitrogen，USA），microRNA 荧光试剂 miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany），microRNA 专用反转录试剂盒miScript Reverse Transcription Kit（Qiagen，Germany），NanoDrop 2000c紫外分光光度计（Thermo Scientific，USA），普 通 RT-PCR 仪 （BIO-RAD，USA），LC 480 荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems，USA），常规试剂及仪器等由北京大学深圳医院男性生殖与遗传中心实验室所提供。

三、miRNA的前期测序及筛选

本研究前期测序由深圳华大基因研究所采用Illumina Hiseq2000测序仪完成。通过第二代测序方法筛选在肾癌组织和癌旁配对正常组织中表达有差异的miRNAs。因目前在其他肿瘤组织中已经有关于miR-20b作为促癌因素的报道，而肾癌组织中miR-20b表达下调，提示其在肾癌发生发展中有着不同的作用机制，因此本研究选用差异表达的miR-20b［log2（T／N）＝-0.89，P＝0.030 3］作为研究对象进行进一步的研究及探讨。

四、总RNA的提取

将选取的42例标本在液氮下碾磨后，按照说明书使用Trizol试剂提取碾磨后标本中的总RNA，之后测定提取得到的总RNA浓度（使用NanoDrop 2000c紫外分光光度计测定）。

五、总RNA反转录为cDNA

根据 miScript Reverse Transcription Kit说明书所述，在反应体系中加入1μg总RNA，在普通PCR仪上进行逆转录。反应条件：37℃60min，95℃5min。合成的cDNA置于-40℃冰箱保存备用。

六、RT-qPCR检测miR-20b

根据 miScript SYBRGreen PCR Kit说明书所述，以逆转录合成的cDNA为模版在LC 480荧光定量PCR仪上进行qPCR反应。反应体系：模板cDNA 1μl，2＊QuantiTectSYBR Green PCR Master Mix 10μl，miR-20b上游引物1μl，10＊miScript通用引物2μl，加无酶水至总反应体积20μl。miR-20b上游引物为5′-AAGTGCTCATAGTGCAG-3′，下游引物使用Qiagen公司提供的通用引物。内参基 因 采 用 U6snRNA，其 上 游 引 物 是：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 引 物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件：95℃15min，94℃15s，之后55℃30s，70℃30s，共计40个循环。

七、数据处理及统计学分析

以U6为内参进行标准化处理，RT-qPCR所得数据使用ΔΔCT法分析：ΔCT＝ CTmiR-20b-CTU6，ΔΔCT＝ΔCTRCC-ΔCTNormal。通过计算2-△CT将得到的ΔCT值还原为miR-20b的相对表达量，经过对数转换，符合正态分布。通过计算2-△△CT得到癌组织中miR-20b表达量相对于配对癌旁组织表达量的倍数，采用SPSS 17.0分析数据。采用配对t检验比较肾癌和癌旁正常组织中miR-20b表达水平，采用四格表χ2检验或Fisher确切概率分析miR-20b表达水平与患者的临床病理特征的联系，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、miR-20b在肾癌及配对癌旁组织中的表达量

miR-20b在肾癌组织中的表达水平明显低于配对癌旁组织。通过2-△CT计算miR-20b在肾癌组织和配对组织中的相对表达量并作图，结果如图1所示，配对t检验分析P＜0.05。通过2-△△CT计算miR-20b在肾癌组织中表达量相对配对癌旁组织表达量倍数的平均值±标准误，为1.020±0.210，最小值为0.051，最大值为7.013；其中，表达量倍数高于1.020＋0.210的视为表达上调，低于1.020-0.210的视为表达下调，其余则为表达无明显差异。肾癌组织miR-20b表达量与配对癌旁组织表达量比值进行log2（T／N）转换，结果如图2所示，表达下调的为29例（69.048%），表达上调的为11例（26.190%），表达无明显差异的为2例（4.762%）。

二、miR-20b表达水平与临床病理特征的相关性

以肾癌组织miR-20b相对表达量平均值1.104为界，将研究病例分为高表达组、低表达组，其中低表达29例，高表达13例。按性别分为男性组及女性组，以患者年龄中位数51岁为界将患者分为＜51岁组和≥51岁组。进行四格表χ2检验分析，结果显示肾癌中miR-20b表达水平与患者年龄、肾癌组织类型、性别、AJCC临床分期、TNM分期无明显相关性（P＞0.05），结果见表1。但该研究结果不能排除病例数较少所致偏倚，需要扩大样本量进一步验证。

图1 miR-20b在肾癌组织和癌旁组织中的ΔCT比较（ΔCT＝CTmiR-20b-CTU6）

图2 miR-20b在42例配对的肾癌和癌旁组织中的相对表达量比值（横坐标为标本序号，纵坐标为miR-20b在肾癌与正常组织中表达量比值的对数值；条带：灰色为表达下调，黑色为表达上调，白色为表达无明显差异）

表1 miR-20b表达量与临床病理特征之间的关系

讨 论

和大多数肿瘤一样，肾癌发生发展的具体分子机制尚不清楚。三分之一的肾癌患者在初次诊断时已经存在远处转移，其中近30%的病例手术后会有复发或者转移［2］。因此寻找可用于肾癌早期诊断的生物标志物显得尤为重要。虽然目前已经发现一些和肾癌诊断及恶性程度相关的生物标志物，但在临床上并无相关标志物的应用，关于这些标志物的作用机制仍需要进一步的研究。现阶段常规的临床分期和病理分期在肾癌预后的判断中仍起主要作

用［12］。

从miRNA被发现到现在，人们对miRNA的研究在逐渐深入。多项研究表明，miRNAs在多种肿瘤细胞中存在异常表达，比如在黑色素瘤中低表达的 miR-205、miR-211［13］，在结肠癌中高表达的miR-31［14］，因此根据miRNA的表达水平不同可以把miRNA分为促癌miRNA和抑癌miRNA，即肿瘤组织中高表达的miRNA可能起到类似于促癌基因的作用，而低表达的miRNA可能具有抑癌基因的作用。在一定的条件下，miRNA通过非特异性结合靶基因mRNA3′端非编码区来抑制其转录或使其降解来调控靶基因表达，从而发挥着基因调控作用［15-16］。由于 miRNA结合的不完全性，一个miRNA可以和多个基因结合，而多个miRNA也可以和同一个基因结合，从而构成一个复杂的调控网络。目前在肿瘤的靶向治疗方面，靶点的选择只是局限于单个异常基因，但miRNA可以和多个基因位点结合，通过调节组织中miRNA的水平即可达到同时调控多个基因的目的。因此，在肿瘤的分子靶向治疗方面miRNA有着独特的优势，所以有必要深入研究miRNA对靶基因的调控机制，以期在肿瘤分子靶向治疗方面取得新的突破。

在先前测序及筛选的基础上，本研究通过逆转录及RT-qPCR检测标本中miR-20b的表达水平，并分析其与病例临床特征的相关性。经统计分析，miR-20b表达水平与患者临床特征无明显相关性。现阶段的研究表明，miR-20b在其他病变组织中也存在着异常表达。目前已有报道证实在乳腺癌中miR-20b表达水平升高，且可通过作用于人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因来促进细胞增殖［17］。另外，也有研究发现miR-20b可以通过和RORγt、STAT3结合来抑制Th17细胞的分化以及脑脊髓炎的发生［18］。

本研究发现miR-20b在肾癌细胞中表达下降，表明其在肾癌中的作用机制与在乳腺癌中有所不同。miR-20b在肾癌组织中明显的低表达，其表达水平是癌旁组织的1.020±0.210倍，提示其可能在基因调控方面发挥着抑癌基因的作用，这可能在肾癌的早期诊断及预后判断方面有一定的临床意义。确定miR-20b表达存在差异后，下一步将是收集更多肾癌标本检测miR-20b的表达，进一步验证miR-20b与肾癌患者临床病理特征及预后的关系并通过体外转染的方法对miR-20b进行功能研究，主要包括研究转染后肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力、凋亡水平等方面的变化。目前普遍认为，miRNA通过复杂的调控网络来调节细胞的生物学行为，因此我们下一步的研究将是如何有效地将特异性较高的miR-20b和其抑制物导入到肾癌细胞中，通过对转染后细胞的功能研究，进一步明确miR-20b在肾癌的发生发展过程中所起的作用。

总之，本研究发现miR-20b在肾癌组织中表达下调，且其表达水平与患者临床病理特征无明显相关性。目前关于miR-20b的功能研究尚处于探索阶段，但根据目前研究状况，探究其对癌细胞功能的影响，寻找其靶基因及作用通路已成为明确目标。本研究为miR-20b在肾癌发生发展中的作用机制以及其在肾癌中的诊断价值等后续研究奠定了基础。

［1］ Alt AL，Boorjian SA，Lohse CM，et al.Survival after complete surgical resection of multiple metastases from renal cell carcinoma［J］.Cancer，2011，117（13）：2873-2882.

［2］ Tostain J，Li G，Gentil-Perret A，et al.Carbonic anhydrase 9in clear cell renal cell carcinoma：A marker for diagnosis，prognosis and treatment［J］.Eur J Cancer，2010，46（18）：3141-3148.

［3］ Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［4］ Li M，Zhang G，Zhang X，et al.Overexpression of B7-H3in CD14（＋）monocytes is associated with renal cell carcinoma progression［J］.Med Oncol，2014，31（12）：349.

［5］ Rasmussen F.Metastatic renal cell cancer［J］.Cancer Imaging，2013，13（3）：374-380.

［6］ Coskun M，Bjerrum JT，Seidelin JB，et al.miR-20b，miR-98，miR-125b-1＊，and let-7e＊as new potential diagnostic biomarkers in ulcerative colitis［J］.World J Gastroenterol，2013，19（27）：4289-4299.

［7］ Hoheisel JD，Wang X，Sundquist J，et al.Determination of 14Circulating microRNAs in Swedes and Iraqis with and without Diabetes Mellitus Type 2［J］.PloS one，2014，9（1）：e86792.

［8］ Juan D，Alexe G，Antes T，et al.Identification of a MicroR-NA Panel for Clear-cell Kidney Cancer［J］.Urology，2010，75（4）：835-841.

［9］ Friedman RC，Farh KK，Burge CB，et al.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs［J］.Genome Res，2009，19（1）：92-105.

［10］ Grange C，Collino F，Tapparo M，et al.Oncogenic micro-RNAs and renal cell carcinoma［J］.Front Oncol，2014，4：49.

［11］ Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al.Circulating microRNA：a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans［J］.Eur Heart J，2010，31（6）：659-666.

［12］ Wood CG.Molecular markers of prognosis in renal cell carcinoma：Insight into tumor biology helps define risk and provides targets for therapy［J］.J Surg Oncol，2006，94（4）：264-265.

［13］ Xu Y，Brenn T，Brown ER，et al.Differential expression of microRNAs during melanoma progression：miR-200c，miR-205and miR-211are downregulated in melanoma and act as tumour suppressors［J］.Br J Cancer，2012，106（3）：553-561.

［14］ Wang S，Hu J，Zhang D，et al.Prognostic role of microRNA-31in various cancers：a meta-analysis［J］.Tumour Biol，2014，35（11）：11639-11645.

［15］ Xu L.miR-203regulates the proliferation，apoptosis and cell cycle progression of pancreatic cancer cells by targeting Survivin［J］.Mol Med Rep，2013，8（2）：379-384.

［16］ Zhai Q，Zhou L，Zhao C，et al.Identification of miR-508-3p and miR-509-3p that are associated with cell invasion and migration and involved in the apoptosis of renal cell carcinoma［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，419（4）：621-626.

［17］ Zhou W，Shi G，Zhang Q，et al.MicroRNA-20bpromotes cell growth of breast cancer cells partly via targeting phosphatase and tensin homologue（PTEN）［J］.Cell Biosci，2014，4（1）：62.

［18］ Zhu E，Wang X，Zheng B，et al.miR-20bsuppresses Th17 differentiation and the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis by targeting RORgammat and STAT3［J］.J Immunol，2014，192（12）：5599-5609.