日本乙型脑炎LAMP方法的建立和应用

2015-12-02孙圣福陈静田夫林马惠玲楚遵锋王敏山东省动物疫病预防与控制中心250022

中国畜禽种业 2015年5期

孙圣福陈静田夫林马惠玲楚遵锋王敏（山东省动物疫病预防与控制中心 250022）

日本乙型脑炎LAMP方法的建立和应用

孙圣福陈静田夫林马惠玲楚遵锋王敏（山东省动物疫病预防与控制中心 250022）

日本乙型脑炎（Japaneseencephalitis，JE，简称乙脑）是一种由乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）引起的人畜共患的病毒性疾病。对于人类和动物的健康有极大的威胁，主要引起人的神经性疾病以及猪的繁殖障碍。

本研究针对乙型脑炎病毒的M基因设计一套RT-LAMP特异性引物，建立了用于乙脑病毒快速诊断的病原学检测方法。与传统的RT-PCR方法相比，该方法操作简便，时间短，对仪器设备要求较低，检测结果肉眼下即可观察结果，临床应用简便。

1 材料和方法

1.1 材料

病毒：乙脑减毒克隆98株；临床病料来自本实验室门诊采集自山东省各市县养猪场疑似乙脑的病料。

1.2 主要仪器和试剂

凝胶成像及分析系统为美国BIO-RADGEL型，PCR仪为德国Biometra公司生产的Tgradient型，台式冷冻离心机为德国Sigma2k-15型，生物安全柜为NU-425-400E3型，电泳槽为北京六一仪器厂。

Loopamp试剂盒购自荣研株式会社，SYBRGREENI核酸染料购自Solarbio公司；DL2000DNAMarker、20bpLadder DNAMarker、反转录酶M-MLV、一步法RT-PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；RNA提取试剂Trizol购自大连宝生物公司。日本乙脑RT-PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。

1.3 引物

根据已经报道的JEV的M基因，利用LAMP引物在线设计软件PrimerExplorerV4.0设计出RT-LAMP反应中使用的4条特异性引物，引物由TAKARA公司合成，序列如下：

表1 引物序列

1.4 核酸提取

待检样品100ul，加Trizol试剂1ml。充分混匀，室温5min，加三氯甲烷 200ul，混匀，室温 5min。12000rpm，15min（2～8℃），取上清80%于另一离心管，加入500ul异丙醇，混匀，室温 10min， 12000rpm， 10min（2～8℃），弃上清，加75%乙醇洗涤，7500rpm，5min（2～8℃），弃上清，风干，加20ul0.1%DEPC水溶解，-20℃储存备用。

1.5 RT-LAMP体系优化

根据反应体系优化策略，对反应温度、Mg2+浓度、甜菜碱浓度、引物浓度进行优化，反应温度依次：60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，甜菜碱浓度分别为0.5、1、1.5、2M，内引物浓度分别为1.2、1.6、2.0、2.4μM，外引物浓度分别为0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0μm，反应时间：20、30、45、60min，确定最佳的反应体系，25μl反应体系：F3/B3 0.2μm、 FIP/BIP1.6μm、 dNTP0.4mm、 MgSO44mm、 Betaine1M、 BstDNA 聚合酶 1μl、 10×Thermobuffer2.5μl、 AMV反转录酶10U，RNA酶抑制剂20U，模板2μl，ddH2O补齐至 25μl。 63℃45min， 80℃2min。取 6μl扩增产物于 1%琼脂糖凝胶上进行电泳，剩余产物中加入1μl核酸染料观察颜色变化。