SPE-UPLC-Q-TOF MS测定育发化妆品中人参和甘草类功效成分

席绍峰，李慧勇，谭建华，徐汉虹，王继才，熊小婷，赵田甜，冼燕萍，郭新东（1.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广东广州 510642；2.华南农业大学农学院，广东广州 510642.广州质量监督检测研究院，国家化妆品质量监督检验中心（广州），广东广州 510110；）

SPE-UPLC-Q-TOF MS测定育发化妆品中人参和甘草类功效成分

席绍峰1，2，3，李慧勇3，谭建华3，徐汉虹1，2，王继才3，熊小婷3，
赵田甜3，冼燕萍3，郭新东3
（1.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广东广州 510642；2.华南农业大学农学院，广东广州 510642
3.广州质量监督检测研究院，国家化妆品质量监督检验中心（广州），广东广州 510110；）

建立了甲醇超声提取，阴离子交换固相萃取（SPE）净化，超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF MS）测定育发化妆品中3种人参皂甙（Rg1、Rb1、Re）和2种甘草类功效成分（甘草次酸和光甘草定）。样品采用甲醇超声提取，MAX（500g／6L）固相萃取小柱净化，以甲醇-0.002%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，在色谱柱HSS T3（2.1m×100mm×1.8μm）上分离，于UPLC-Q-TOF MS负离子模式下检测。同时，对固相萃取条件和色谱-质谱条件进行了优化，并对方法学进行了验证。结果表明：5种目标化合物在5～200μg／L浓度范围内均呈良好的线性关系，线性相关系数大于0.999；方法检出限为0.03～0.1mg／kg（S／N＝3）；在膏霜和洗发水基质中的加标回收率为71.9%～94.2%，相对标准偏差小于15.4%（n＝6）；分子质量偏差小于5×10-6。该方法适用于育发化妆品（特别是表面活性剂及油脂含量高的样品）中人参皂甙和甘草类功效成分的定性定量检测。

固相萃取（SPE）；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF MS）；育发化妆品；人参；甘草；功效成分

人参和甘草是常见的中草药植物，已有研究证明，人参和甘草提取物除了在皮肤护理领域中具有美白功效［1-2］外，也表现出较好的育发功效。赵玉磊等［3］和Park等［4］均通过C57BL／6小鼠模型的毛囊细胞实验证明了人参等中药能明显减少退行期毛囊内细胞凋亡，诱导和延长毛发的生长期；朱海琴等［5］研究认为甘草提取物能增强毛乳头细胞分泌VEGF，从而起到促进毛发生长的作用。随着对人参、甘草提取物育发功效研究的深入，它们在育发化妆品中的应用日益广泛。然而，由于相关检测方法的缺失，目前对于市售人参和甘草提取物类育发化妆品的质量监管基本处于空白，导致出现了较多假冒伪劣、虚假宣传等不良现象。因此，亟需建立相应的检测方法对育发化妆品中人参和甘草类功效成分进行测定。

目前，关于人参和甘草类功效成分的检测研究大多是针对中药材植物［6-11］和药物产品［12-16］等，主要采用高效液相色谱法［15-16］和高效液相色谱-质谱联用法［6-14］进行检测。其中，由于人参皂甙类化合物的紫外吸收为末端吸收，常用的高效液相色谱-紫外检测法在分析基质较为复杂的样品时，往往无法取得满意的灵敏度和选择性。在高效液相色谱-质谱联用技术中，飞行时间质谱由于能获得化合物的精确质量数、准确的同位素丰度及丰富的质谱信息，在植物功效成分的定性或定量检测研究［6，9-11］具有突出优势。

本实验选择3种人参皂甙（Rg1、Rb1、Re）和2种甘草功效成分（甘草次酸和光甘草定）为检测对象，其结构式示于图1。采用固相萃取技术对含高表面活性剂的育发化妆品进行有效净化，结合超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱技术，定性定量检测育发化妆品中人参和甘草类功效成分。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

图1 5种目标化合物的结构式Fig.1 Structures of 5target compouds

超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱仪：美国Waters公司产品，配有电喷雾离子源（ESI）及Masslynx数据处理系统；Allegra 64R高速冷冻离心机：德国Beckman公司产品；MS3basic漩涡混合器：德国IKA公司产品；BG-02C型超声波发生器：广州邦洁超声设备有限公司产品；24孔位固相萃取装置：上海安谱有限公司产品；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司产品。

1.2 材料与试剂

人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1、人参皂甙Re、甘草次酸和光甘草定对照品：纯度均大于99.0%，上海诗丹德生物技术有限公司产品；甲醇、乙腈：色谱纯，美国Fisher Scientific公司产品；甲酸、氨水、磷酸氢二钠：色谱纯，上海安谱公司产品；待分析的化妆品样品：购自本地不同市场。

OasisHLB小柱（60g／3L）、Sep-Pak C18小柱（60g／3L）、OasisWAX小柱（60g／3L）、OasisMAX小柱（60g／3L、50g／6L、500g／6L）：均为美国Waters公司产品。

分别称取10.0mg（精确至0.01mg）对照品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1g／L的单标标准储备液。分别吸取适量的标准储备液，用甲醇配制成所需的系列混合标准工作溶液，于4℃避光保存。

1.3 实验条件

1.3.1 样品的制备与提取 准确称取0.5g（精确至0.001g）试样于10 mL具塞比色管中，用甲醇定容至刻度，于漩涡振荡器上混合，使样品分散1min，超声提取15min，取上清液于离心管中；以10 000r／min离心5min后，准确量取2mL上清液，加入8mL纯净水，混匀，待固相萃取净化。

1.3.2 固相萃取净化 用6mL甲醇、6mL水活化平衡MAX固相萃取柱，将1.3.1节中制备的溶液以不高于1mL／min的流速通过萃取小柱后，依次用6 mL 5%氨水溶液淋洗，10mL甲醇-水溶液（75∶25，V／V）洗脱人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1和人参皂甙Re，10mL甲醇淋洗高脂溶性杂质，12mL 2%甲酸甲醇溶液洗脱甘草次酸、光甘草定。2种洗脱液分别于65℃水浴中氮吹至小于1 mL，加甲醇至2mL，复溶（可根据样品中目标化合物含量的高低来调整复溶溶剂体积的大小），过滤，待UPLC-Q-TOF MS测定。

1.3.3 色谱条件 色谱柱：HSS T3（2.1m× 100mm×1.8μm）；柱温：35℃；进样体积：5μL；流速：0.3mL／min；流动相：A为0.002%甲酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～2 min、40%～60%B，2～5 min、60%～100%B，6～8min、100%～40%B。

1.3.4 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），负离子模式；毛细管电压：2.5kV；萃取锥孔电压：45V；脱溶剂气温度：450℃；离子源温度：100℃；脱溶剂气流速：600L／h；锥孔气流速：50L／h；四极杆采集质量数范围：m／z100～1 000。数据采集模式：棒状（centroid）；扫描采集时间：0.2s；TOF运行模式：V模式；以200μg／L亮氨酸脑啡肽（m／z 554.261 5）溶液进行实时校准。

2 结果与讨论

2.1 SPE条件优化

育发化妆品基质复杂，其表面活性剂和油脂的含量很高，如果不经净化直接进入质谱仪会引起严重的离子抑制，甚至会污染整个质谱系统。本研究选择最常见的两种育发化妆品，即膏霜（含油脂和非离子表面活性剂）和洗发液（含阴离子表面活性剂）样品，采用简单溶剂提取后进入UPLC-Q-TOF MS分析。结果发现：在膏霜样品中，色谱保留较强的甘草次酸和光甘草定的响应抑制为10%～50%，这主要是因为与硬脂酸酯等油脂类化合物共出峰而产生的离子抑制；在洗发液样品中，高含量的十二烷基硫酸铵（ALS）、月桂醇聚醚硫酸酯钠（AES）等阴离子表面活性剂几乎将人参皂甙Rb1、甘草次酸和光甘草定的离子响应完全抑制，甚至造成严重的残留效应，其总离子流图示于图2。基于以上原因，本研究采用固相萃取方式对样品进行净化。

图2 洗发液样品经MAX柱净化（a）和未经净化（b）的总离子流图Fig.2 Total ion current chromatograms of paste shampoo with purified by MAX（a）and no purification（b）

实验比较了4种不同填料类型的固相萃取小柱的净化效果，包括以反相保留为主的OasisHLB和Sep-PakC18柱、弱阴离子交换的OasisWAX柱、强阴离子交换的OasisMAX柱。实验发现：HLB和C18柱只能去除少量强保留的油脂，却无法去除阴离子表面活性剂；WAX柱能去除阴离子表面活性剂，但很难使弱离子交换能力的甘草次酸和光甘草定与阴离子表面活性剂完全分离；MAX柱为聚合物基质的混合型强阴离子交换柱，同时具有阴离子交换和反相保留能力。

待分析的5种目标化合物的化学性质参数列于表1。其中，3种人参皂苷类物质的反相保留相对较弱，可通过优化洗脱溶剂强度与油脂杂质分离；而2种甘草类物质由于具有酚羟基，可通过离子交换吸附在色谱柱上进行锁定保留，采用甲醇淋洗将无离子交换能力的非极性油脂完全去除。由于MAX柱的强阴离子交换能力可以将阴离子表面活性剂进行不可逆的吸附；甘草次酸和光甘草定与MAX柱的吸附较弱，但采用2%甲酸甲醇溶液即能完全洗脱，从而达到油脂与阴离子表面活性剂杂质的完全分离。因此，本研究采用MAX柱对样品提取液进行净化。

表1 目标化合物的化学性质参数Table 1 Chemical properties of target compouds

实验进一步比较了不同规格的MAX柱（60g／3L、150g／6L和500g／6L）的净化效果。结果发现，由于MAX的离子交换量较小（约为0.25meq／g），而洗发液中的阴离子表面活性剂含量可能超过5%，甚至更高，导致在本方法的稀释倍数下，阴离子表面活性剂在60g／3L 和150g／6LMAX柱上因吸附过载而被洗脱。因此，本研究采用500g／6L的MAX柱。

确定固相萃取柱之后，实验优化了人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1、人参皂甙Re的洗脱溶剂条件。采用体积比分别为60∶40、70∶30、75∶25、80∶20的甲醇-水溶液对目标化合物进行洗脱，结果示于图3。由图3可见，人参皂甙Rg1和人参皂甙Re在体积比为60∶40的甲醇-水溶液条件下能被基本洗脱，而人参皂甙Rb1在体积比为75∶25的甲醇-水溶液条件下才能被完全洗脱。考虑到甲醇的比例越高，杂质被洗脱的越多，因此，本研究采用体积比为75∶25的甲醇-水溶液对人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1和人参皂甙Re进行洗脱。

图3 3种人参皂甙化合物的固相萃取洗脱条件优化Fig.3 Optimization of SPE washing conditions of three ginsenoside compouds

对空白育发膏霜和洗发液进行样品加标回收实验时发现，样品稀释液（上固相萃取柱的溶液）中甲醇比例的高低将会影响膏霜样品中甘草次酸和光甘草定的加标回收率。这可能是因为膏霜样品中含油脂成分较高，样品的甲醇提取液用纯净水稀释后会由于油脂溶解度的降低而产生浑浊乳化现象。由于甘草次酸和光甘草定具有较高的酯溶性（log P值已列于表1），可能会在浑浊小颗粒上被少量吸附，而使回收率偏低。本研究尝试采用破乳、过滤等方法去除小颗粒，均未能有效提高回收率，而通过增加稀释液中的甲醇比例，使膏霜中油脂小颗粒减少，却能提高甘草次酸和光甘草定的回收率。但是，由于人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1和人参皂甙Re的反相保留能力较弱，增加稀释液的甲醇比例至30%时即会导致人参皂甙Rg1发生部分流失。经综合考虑，本研究将样品的甲醇提取液用超纯水按甲醇-水（2∶8，V／V）的比例稀释后再过固相萃取小柱。

2.2 UPLC-Q-TOF MS条件优化

研究了5种目标化合物在电喷雾正负离子模式下的响应特点，结果显示，5种化合物在正负离子模式下均有较强的离子响应，其中，3种人参皂甙化合物在正离子模式下主要以［M＋Na］＋形式存在。考虑到育发化妆品中常用的非离子型表面活性剂（如脂肪醇聚氧乙烯醚等）在正离子模式下的离子响应特别强，会对目标化合物产生离子抑制，本研究选用负离子模式进行分析。

通过比较不同流动相溶液（甲醇-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液）对5种目标化合物的色谱峰形和离子化效率的影响，发现3种人参皂甙化合物在乙腈体系流动相中的离子化效率要低于甲醇体系。由于甘草次酸具有羧基基团（pKa＝4.44），含甲酸的流动相能使其获得对称、尖锐的峰型，示于图3，但流动相中的甲酸同时会对目标化合物产生离子抑制。本研究采用不同体积浓度的甲酸水溶液（0.001%、0.002%、0.005%、0.020%、0.010%、0.1%）为流动相进行实验，结果发现，流动相中甲酸浓度在0.002%时，目标化合物的离子抑制不明显，且能保证较好的色谱峰形，但随着甲酸浓度的增加，离子抑制效应越来越强。因此，本研究选用甲醇-0.002%甲酸水溶液为流动相。

5种目标化合物的提取离子质谱图示于图4。5种目标化合物的分子离子［M-H］-较为稳定，具有较强的丰度响应，但是，由于流动相体系中含有一定比例的甲酸，3种人参皂甙化合物的加酸离子［M＋HCOO］-也表现出较高丰度。因此，本研究以［M-H］-和［M＋HCOO］-为目标，对毛细管电压、锥孔电压、萃取电压、脱溶剂气温度、离子源温度、脱溶剂气流速等质谱参数进行了优化。结果发现，锥孔电压对于［M-H］-和［M＋HCOO］-丰度的影响较大，且5种目标化合物最佳灵敏度时的锥孔电压均不一致。为了使5种目标化合物均能得到较为满意的灵敏度，本研究最终选择锥孔电压为50V，人参皂甙Rg1选取［M＋HCOO］-为定量离子，其他化合物均选取［M-H］-为定量离子。另外，本实验同时采集第2质谱通道，通过施加梯度碎裂电压（20～55V）将定量离子打碎，得到一个最大丰度的碎片离子峰。通过保留时间，分子离子和一个碎片离子的精确质量数进行定性确证。结果显示，本实验得到的分子质量准确度较高，与理论值的误差均在5×10-6以内，详细数据列于表2。

分别配制质量浓度为5.0～200μg／L的系列标准溶液，在本实验条件下，对目标化合物进行测定，根据定量离子丰度面积积分值（y）与相应质量浓度（x，μg／L）的响应关系，得到线性回归方程及线性相关系数，结果列于表3。结果表明，在5.0～200μg／L范围内，5种目标化合物的线性关系良好，R2均在0.999以上。本实验采用基质样品加标，通过计算标样的响应与背景噪音的比值（S／N＝3），得到3种人参皂甙的方法检出限均为0.1mg／kg，甘草次酸和光甘草定的方法检出限为0.03mg／kg。

2.3 方法回收率和精密度选用膏霜和洗发水两种不同基质类型的空白育发化妆品为加标基质，进行0.1、1.0、2.0mg／kg 3个添加水平的回收率与精密度实验，结果列于表4。结果显示，3个浓度添加水平的回收率为71.9%～94.2%，相对标准偏差小于15.4%。

图4 5种目标化合物的提取离子质谱图Fig.4 Extracted ion chromatograms of 5target compouds

表2 目标化合物的保留时间，精确分子质量，理论分子质量和质量精确度Table 2 Retention time，accurate molecular mass，theory molecular mass and mass accuracy of target compouds

表3 目标化合物的线性方程、线性范围、相关系数和方法检出限Table 3 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients（R2）and method detection limit of five target analytes

表4 回收率和精密度测定结果（n＝6）Table 4 Determination results of recoveries and precisions（n＝6）

2.4 实际样品的测定

采用本方法对10份育发化妆品进行人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1、人参皂甙Re、甘草次酸和光甘草定含量的检测。实验结果显示，在其中的2份育发化妆品中检出人参皂甙Rg1、人参皂甙Rb1和人参皂甙Re，含量在10～32mg／kg之间，典型的育发化妆品的提取离子质谱图示于图5。

3 结论

本工作建立了固相萃取-超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法分析测定育发化妆品中3种人参功效成分和2种甘草功效成分。通过采用强阴离子交换固相萃取净化技术，同时利用其离子交换和反相保留能力，有效地解决了育发化妆品中高含量表面活性剂和油脂的强基质干扰问题。将超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法应用于育发化妆品中人参和甘草类功效成分的鉴定，具有高灵敏度和高确证性的特点，可为育发化妆品中相关功效成分的质量监控提供重要的方法依据。

图5 典型的育发化妆品中5种目标化合物的提取离子质谱图Fig.5 Extracted ion chromatograms of 5target compounds in real sample

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Determination of Active Constituents of Ginseng and Glycyrrhizae in Hair Growth Cosmetics by SPE-UPLC-Q-TOF MS

XI Shao-feng1，2，3，LI Hui-yong3，TAN Jian-hua3，XU Han-hong1，2，WANG Ji-cai3，XIONG Xiao-ting3，ZHAO Tian-tian3，XIAN Yan-ping3，GUO Xin-dong3
（1.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agrobioresources，Guangzhou510642，China；
2.The College of Agricultural of South China Agricultural University，Guangzhou510642，China；
3.Guangzhou Products Quality Supervision and Testing Institute，National Center
for Quality Supervision and Testing of Cosmetics（Guangzhou），Guangzhou510110，China）

A method for the determination of three active constituents of ginseng（ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1and ginsenoside Re）and two active constituents of gly-cyrrhizae（glycyrrhetic acid and glabridin）in hair growth cosmetics was developed by strong anion exchange-solid phase extraction（SPE）combined with ultra-performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF MS）.The sample was extracted by methanol through ultrasonic wave，and purified by SPE（MAX，500g／6L）cartridge.Chromatographic separation was conducted on an UPLC HSS T3（2.1m×100mm×1.8μm）column with gradient elution using methanol and 0.002%fomic acid solution as mobile phases.MS analysis was set in electrospray ionization operated in negative mode.The experiment conditions of SPE（adsorbing materials and washing solvents）and UPLC-Q-TOF MS（mobile phases，ionization mode and mass spectrometric parameters）were optimized.The results demonstrate that the method shows good linearity in the concentration range of 5-200μg／L，with correlation coefficients no less than 0.999for the five investigated analytes.The limits of detection are in the range of 0.03-0.1mg／kg（S／N＝3）.The average recoveries in sample matrix of cream and paste shampoo are from 71.9%to 94.2%with relative standard deviations （RSDs）less than 15.4%（n＝6）.High resolution Q-TOF MS gives accurate mass measurement for identification of the target analytes from complicated matrices，with mass errors below 5×10-6.The method is suitable for the determination of ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1，ginsenoside Re，glycyrrhetic acid and glabridin in hair growth cosmetics，particularly for those containing high content of surfactants and greases.

solid phase extraction（SPE）；ultra-performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF MS）；hair growth cosmetics；ginseng；glycyrrhizae；active constituents

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0341-09

10.7538／zpxb.youxian.2015.0022

2014-09-11；

修回日期：2014-11-15

国家质检总局公益性行业科研专项项目（2012104013-3）；广东省质量技术监督局科技项目（2011cz01）资助

席绍峰（1972—），男（汉族），河南人，高级工程师，从事色谱质谱检测技术研究。E-mail：davidxi-007＠163.com

谭建华（1982—），男（汉族），湖南人，博士研究生，从事色谱质谱检测技术研究。E-mail：tanjianhua0734＠aliyun.com

时间：2015-05-26

；

http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150526.0903.004.html