固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测血液中海洛因及其代谢产物

张 松，曹峻华，刘文文（.重庆市公安局交通管理局，重庆 400054；.重庆市公安局物证鉴定中心，重庆 4000）

固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测血液中海洛因及其代谢产物

张 松1，曹峻华1，刘文文2
（1.重庆市公安局交通管理局，重庆 400054；2.重庆市公安局物证鉴定中心，重庆 400021）

建立了固相萃取-液相色谱-串联质谱（SPE-LC-MS／MS）法分析吸毒者血样中的O6-单乙酰吗啡、吗啡、3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡。以3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡-d3为内标，选取Oasis HLB为固相萃取柱，AtlantisTMdC18（150mm×3.9mm×5μm）色谱柱为分析柱，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；采用电喷雾正离子电离源，多反应监测（MRM）扫描方式，通过两对母离子／子离子和保留时间定性定量检测目标化合物。结果表明：血样中O6-单乙酰吗啡、吗啡、3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡的检测限为3～5μg／L，线性关系良好，相关系数均在0.997 5以上；添加50、500、1 000μg／L加标水平后，O6-单乙酰吗啡、吗啡、3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡的平均回收率为80.6%～98.9%，准确度为-7.3%～9.1%。该方法具有较高的灵敏度和选择性，可用于实际案件中海洛因及其代谢产物的检测。

液相色谱-串联质谱法（LC-MS／MS）；固相萃取（SPE）；O6-单乙酰吗啡；吗啡；3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡

海洛因又称双乙酰吗啡，是目前依赖潜力最强的毒品，成瘾者对其具有高度的心理及生理依赖性，难以戒除。因此，及时准确地检测海洛因及其代谢产物，对于防止毒品泛滥、禁毒及戒毒、保护人民身心健康具有重大意义。海洛因在体内的代谢较快，经体内的酯酶水解成单乙酰吗啡（主要是O6-单乙酰吗啡），继而代谢成吗啡，吗啡的3位酚羟基和6位醇羟基分别与葡萄糖醛酸结合，绝大部分生成3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡（M3G），少量转化为6-β-D-葡萄糖醛酸吗啡（M6G）［1-2］。因此，在人体内很难检测到海洛因原体，O6-单乙酰吗啡则作为特征代谢产物被用于判断是否摄入海洛因的依据。

海洛因及其主要代谢产物的常用检测方法有GC／MS法［3-5］、高效液相色谱法（HPLC）法［6-7］、LC／MS［8-9］法及LC-MS／MS法［10-12］等。其中，GC／MS法需要酸水解，整个过程的检材量大、操作复杂、不易控制、无法准确定量；HPLC法的检测器灵敏度较低，在检测药物含量较低时会导致无法检出；LC／MS法的抗干扰能力较差；而LC-MS／MS法将液相色谱的高效在线分离能力与串联质谱的高灵敏度、高选择性集于一体，能够满足实际检测的要求。

本研究拟采用固相萃取法（SPE）对检材进行前处理，LC-MS／MS法检测血液中海洛因及其主要代谢产物（O6-单乙酰吗啡、吗啡、3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡），旨为临床、法医毒物分析检测提供方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

API2000LC-MS／MS联用仪：美国ABI公司产品；LC-20A型高效液相色谱仪，Caliper Rapid Trace固相萃取仪：日本岛津公司产品；AE240电子天平（十万分之一）：瑞士Mettler公司产品；Beckman Allegra X-22RCentrifuge型冷冻离心机：美国Beckman公司产品；Millipore Direct-Q3型纯水机：美国Millipore公司产品。

海洛因、吗啡、3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡、O6-单乙酰吗啡标准品及3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡-d3（M3G-d3）内标物：均由国药公司提供；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

实验数据采用Analyst1.4.1分析软件处理。

1.2 溶液的配制

分别准确量取1mg O6-单乙酰吗啡、吗啡、M3G标准品于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100mg／L混合标准样品储备液。分别准确量取0.1、0.2mL混合标准样品储备液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1、2mg／L混合标准工作液。取0.05mL 100mg／L M3G-d3标准品于50mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100μg／L内标工作液。

1.3 工作曲线的绘制

将100mg／L混合标准样品储备液分别配制成0.1、0.5、1、5、20mg／L 5个不同浓度的混合标准品溶液，取5份0.9mL空白全血，依次加入0.1mL各浓度的混合标准品溶液，混匀后，用含1.5mL 100μg／L M3G-d3的水溶液稀释，离心，经固相萃取柱（Oasis HLB）萃取后，用液相色谱-质谱联用仪检测，由Analyst1.4.1分析软件绘制标准曲线。

1.4 样品处理方法

向1mL血液样品中加入含1.5mL 100μg／L M3G-d3的水溶液稀释，离心，取上清液，待过柱；取Oasis HLB固相萃取柱，依次加入1mL甲醇、1mL去离子水活化，取上清液过柱，然后用1mL去离子水清洗，2mL甲醇洗脱，氮气吹干，0.5mL初始流动相溶解，待检测。

1.5 实验条件

1.5.1 液相色谱条件 色谱柱：AtlantisTMdC18柱（150mm×3.9mm×5μm）；流速0.5mL／min；柱温35℃；进样量20μL；流动相：甲醇（A）和0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：0～3 min、 20%A～90%A，3～9min、90%A～20%A；总采样时间12min。

1.5.2 质谱条件 电喷雾（ESI）离子源，多反应监测（MRM）扫描方式，正离子扫描，电喷雾电压5 200V，雾化气压力35Pa，气帘气压力20Pa，离子源温度400℃，碰撞气为氩气。每个化合物设两对母离子／子离子（3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡和内标只有1对母离子／子离子响应较明显），各MRM参数列于表1。

表1 吗啡、3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡、内标、O6-单乙酰吗啡、海洛因的MRM参数Table 1 MRM parameters of morphine，M3G，M3G-d3，O6-monoacetylmorphine and heroin

2 结果与讨论

2.1 色谱图

按1.5节条件测得的人空白全血色谱图中不存在3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O6-单乙酰吗啡、海洛因等药物的干扰，也无其他杂质，说明本方法的特异性良好。

3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡及内标、吗啡、O6-单乙酰吗啡、海洛因在1.5.1节条件下的保留时间分别为4.61、5.81、7.29、8.49min，色谱行为良好，其总离子流色谱图示于图1。

2.2 线性关系、检测限与定量下限

取经1.2和1.4节处理好的样品，用液相色谱-串联质谱仪分析，以峰面积与内标峰面积之比（y）对样品中化合物的浓度（x）作图，各化合物的线性关系良好；当信噪比S／N＝3时，3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O6-单乙酰吗啡的定量下限均为10μg／L；各化合物的检测限、线性回归方程和相关系数列于表2。

2.3 回收率、精密度及准确度

向空白全血中添加低、中、高3个质量浓度的混合标准工作液，使添加标样的浓度分别为50、500、1 000μg／L，每个加标水平取5个平行样，测得各加标水平的平均回收率，同时计算各浓度血样测定结果的准确度，结果列于表3。重复测定低、中、高浓度的样品6次，得到日内精密度；连续测定4天，得到日间精密度，结果列于表4。

图1 3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡及内标（a）、吗啡（b）、O6-单乙酰吗啡（c）和海洛因（d）的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of M3Gand M3G-d3（a），morphine（b），O6-monoacetylmorphine（c）and heroin（d）

表2 3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡、吗啡和O6-单乙酰吗啡的检测限、定量限和线性关系Table 2 The detection limits，quantification limits，linear equations and coefficients of M3G，morphine and O6-monoacetylmorphine

表3 3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O6-单乙酰吗啡的回收率和准确度Table 3 The recoveries and accuracies of M3G，morphine，O6-monoacetylmorphine

表4 3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O6-单乙酰吗啡的日内和日间精密度Table 4 The intra-day and inter-day precisions of M3G，morphine，O6-monoacetylmorphine

2.4 实际应用举例

案例1：2013年7月，李某驾驶小型轿车在重庆市某区人民法院前路段与6车发生连续相撞，造成1人重伤，7车受损的重大道路交通事故。事故发生后，民警发现李某有吸毒驾驶机动车嫌疑，后在李某血液中检出吗啡和3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡，其含量分别为126μg／L、83μg／L。

案例2：2014年2月，在重庆市南岸区发生了一起司机刘某死于自己车内的事件，其右手握有塑料针管，针头部分有血迹。后在死者所持针管中检出海洛因、单乙酰吗啡；在刘某血液中检出O6-单乙酰吗啡、吗啡和3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡，其含量分别为221μg／L、983μg／L（已达致死量）、392μg／L，其色谱图示于图2。

3 结论

本研究建立了固相萃取-液相色谱-串联质谱快速检测海洛因及其代谢产物的方法，可实现4种药物在10min内的快速检测。该方法的抗干扰能力强、检测速度快，具有保留时间和串联质谱特征离子对确证的优点；且定量准确、灵敏度高，能满足同时检测海洛因、3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡、吗啡和O6-单乙酰吗啡4种药物的要求。

图2 案件2的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of case two

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Determination of Heroin and Its Metabolites in Addicts’Blood by Solid Phase Extraction and LC-MS／MS

ZHANG Song1，CAO Jun-hua1，LIU Wen-wen2
（1.Chongqing Traffic Management Bureau，Chongqing400054，China；
2.Chongqing Institute of Forensic Science，Chongqing400021，China）

O6-Monoacetylmorphine，morphine，morphine-3-β-D-glucuronide in addicts’blood samples were analyzed by solid phase extraction（SPE）and liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS／MS）.The samples were extracted by extraction column（Oasis HLB），and then were flushed into the analytical column（AtlantisTMdC18（150mm×3.9mm×5μm））with methanol and water containing formic acid as mobile phase and morphine-3-β-D-glucuronide-d3as internal standard.The positive electric spray ionization，multiple reaction monitoring（MRM）mode were applied to analyze target compounds.Identification was based on the compound’s retention time and two pairs of precursor-to-product ion transitions.The results show that the limit of detections are 3-5μg／L for morphine，O6-monoacetylmorphine and morphine-3-β-D-glucuronide.The linear relationship is well，and the linear correlation coefficient is greater than 0.997 5.The average recoveries are 80.6%-98.9%with the spiked levels of 50，500，1 000μg／L，and the accuracies are-7.3%-9.1%.The method has high sensitivity and selectivity，which is suitable for analyzing the heroin and its metabolites in addicts’blood samples.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS／MS）；solid phase extraction（SPE）；O6-monoacetylmorphine；morphine；morphine-3-β-D-glucuronide

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0367-05

10.7538／zpxb.youxian.2015.0020

2014-08-22；

修回日期：2014-12-01

张 松（1978—），男（汉族），山东济宁人，工程师，从事理化检验工作。E-mail：zhangsong＿2008＠163.com

时间：2015-05-26；

网络出版地址：http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150526.0915.006.html