31例维吾尔族黏膜黑素瘤临床与c-kit基因突变研究

柴莉 康晓静 孙振柱 高峰 时晓辉 于世荣 陈文静吴秀娟 丁媛 梁俊琴 刘文先 普雄明

31例维吾尔族黏膜黑素瘤临床与c-kit基因突变研究

柴莉 康晓静 孙振柱 高峰 时晓辉 于世荣 陈文静吴秀娟 丁媛 梁俊琴 刘文先 普雄明

目的 分析维吾尔族黏膜黑素瘤临床特点，检测c-kit基因突变，探讨与黏膜黑素瘤临床特征之间的关系。方法 收集经病理确诊的31例维吾尔族黏膜黑素瘤患者的临床资料，采用PCR及DNA直接测序法进行c-kit基因突变检测。结果 维吾尔族黏膜黑素瘤男女性别比为1∶1.2，平均年龄61.35岁。60～70岁为高发年龄段，51～59岁为次高发年龄段。头颈部为最常见的发病部位，其中以鼻腔黏膜居多；其次为泌尿生殖道和直肠黏膜。31例黏膜黑素瘤有4例发生c-kit基因突变（12.9%，4/31），突变均位于11外显子，以L576P突变为主。4例突变中，3例发生于直肠黏膜，1例发生于尿道黏膜。直肠黏膜与其他黏膜部位c-kit基因突变率分别为3/7、4.17%（1/24）。发生淋巴结转移患者c-kit基因突变率高于无淋巴结转移者（P=0.043）。c-kit基因突变与性别、年龄无相关性（P＞0.05）。结论 维吾尔族黏膜黑素瘤好发于老年人，发病部位以头颈部黏膜为主。c-kit基因突变与黏膜黑素瘤发生部位、有无淋巴结转移密切相关。

黑色素瘤；黏膜；维吾尔族；原癌基因蛋白质c-kit；突变

黏膜黑素瘤是起源于呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜的高度恶性肿瘤［1］。起病隐匿、临床无特征性、不易早期发现，5年生存率为 25%［2］；若发生转移，其3年生存率不到15%［3］。肿瘤的发生与介导细胞增殖及凋亡的一些关键基因的突变有密切关系。对黏膜黑素瘤遗传易感基因研究发现，参与MAPK、PI3K/Akt、JAK/STAT等多条信号转导途径的c-kit基因是黏膜黑素瘤中突变率较高的基因，也是目前黏膜黑素瘤特异性靶向治疗研究热点基因。与皮肤黑素瘤相比，黏膜黑素瘤相对少见。目前，关于黏膜黑素瘤的研究资料较少，且多集中于汉族人群［4］。本研究对31例维吾尔族黏膜黑素瘤临床特点进行分析，并对c-kit基因进行突变筛查，探讨与黏膜黑素瘤临床特征之间的关系。

对象与方法

一、对象

新疆维吾尔自治区人民医院病理科及皮肤科2004年1月至2013年12月明确诊断为黏膜黑素瘤的石蜡包埋组织31例及新疆维吾尔自治区人民医院整形科及泌尿外科因外伤或其他原因需切除的部分正常皮肤的石蜡包埋组织10例。所有标本均经组织病理诊断证实。

二、临床资料

1.年龄和性别：31例维吾尔族黏膜黑素瘤患者均无家族史。发病年龄38～83岁，平均年龄61.35岁。31～40岁1例，41～50岁5例，51～59岁 8例，60～70岁10例，71～80岁6例，81～90岁1例。≥60岁17例，＜60岁14例。其中，60～70岁为维吾尔族黏膜黑素瘤患者的高发年龄段，51～59岁为次高发年龄段。男性患者14例，占45.16%；女性患者17例，占54.84%；男∶女为1∶1.2。

2.原发部位：31例维吾尔族黏膜黑素瘤中，12例发生于头颈部，该部位是最常见的原发部位（12/31，38.71%），其中鼻腔黏膜5例，在头颈部黑素瘤中最为多见（5/12）；另有4例发生于口腔黏膜，3例见于眼脉络膜。其他比较常见的部位为泌尿生殖道和直肠黏膜，分别为11例（11/31，35.48%）、7例（7/31，22.58%）。另外，还有少见的食管黏膜黑素瘤1例。17例女性患者中，10例发生于泌尿生殖道（10/17），是女性最常见的发病部位，其中发生于外阴5例，占女性泌尿生殖道5/10，宫颈、阴道各2例，尿道黏膜1例；另有5例发生于头颈部（5/17），是女性患者的另一常见发病部位。男性阴茎患者1例。

3.临床表现及淋巴结转移情况：发生于直肠黏膜的患者临床表现主要为便血、大便性状改变及排便习惯改变；鼻腔黏膜主要症状为鼻塞、鼻出血或涕中带血、肿块形成；口腔黏膜以肿块形成、吞咽不适为主要表现；眼脉络膜则以视力下降、流泪、疼痛为主。外阴部位的常见临床表现为瘙痒、疼痛、出血、外阴肿物；发生于宫颈、阴道者主要表现为疼痛和出血；尿道黏膜表现为血尿和疼痛；阴茎临床表现为肿物形成、疼痛。还有食管黏膜1例，患者主要临床症状为咽部梗阻感。病程：黏膜黑素瘤起病隐蔽，患者多于症状出现数月后才被诊断。患者出现始发症状至明确诊断间隔时间1个月至4年，平均7个月。淋巴结转移情况：8例患者发生淋巴结转移（8/31，25.81%），无淋巴结转移患者23例（23/31，74.19%）。

三、实验方法

1.DNA的提取：石蜡包埋组织DNA提取按试剂盒说明书进行（QIAamp DNA FFPE试剂盒，德国Qiagen公司），提取的DNA放于-20℃保存备用。

2.PCR扩增：特异引物扩增c-kit基因11和13外显子。引物参照文献［5］，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系：总体系50 μl，其中上下游引物各 1 μl，模板 DNA 4 μl，Taq PCR Master Mix 25 μl，双蒸水 19 μl。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min，1个循环；95℃变性30 s，56.5℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃总延伸7 min，1个循环；温度降至4℃终止反应。以双蒸水代替模板DNA作为阴性对照。

3.电泳鉴定：为证实PCR产物中含有目的片段DNA，取PCR扩增产物5 μl，经1.5%琼脂糖凝胶电泳120 V 30 min，鉴定PCR扩增产量和特异性。

4.PCR扩增产物测序：将经电泳鉴定的PCR扩增产物40 μl送上海生工生物工程技术服务有限公司双向测序，所得结果与NCBI基因数据库中的序列进行比对，确定突变位点。同时对10例正常皮肤石蜡包埋组织进行PCR扩增并将扩增产物测序。

四、统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。采用Fisher精确概率法分析各临床特征与c-kit基因突变之间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、组织病理检查

1.巨检：肿瘤大小不等，最大为5.0 cm×4.0 cm×3.5 cm，最小体积为1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm。肿瘤呈扁平或结节状或菜花状，表面暗红色或灰褐色，切面灰褐色或暗黑色，部分瘤体表面充血明显，伴有糜烂或溃疡，质脆（图1）。

2.镜检：镜下见瘤细胞圆形或多边形，胞质淡染，细胞核大、深染，核分裂象可见，胞质内可含有色素颗粒。瘤细胞呈巢状或散在弥漫分布，沿水平和垂直方向扩展（图2）。

二、c-kit基因突变分析

1.目的片段鉴定电泳图：黏膜黑素瘤、正常皮肤组织和阴性对照PCR扩增片段鉴定电泳图（图3，4）。c-kit基因11外显子和13外显子PCR扩增产物长度分别为225 bp、193 bp。

图1 黏膜黑素瘤瘤体组织病理检查 瘤体呈浅灰色，向直肠腔内突出生长，占据管腔2/3，管腔明显狭窄，表面充血

图2 损害组织病理 瘤细胞呈圆形或多边形，核大、深染，核分裂象可见，瘤细胞呈巢状分布（箭头，HE×400）

2.c-kit基因突变类型：31例黏膜黑素瘤中4例发生c-kit基因突变，均位于11外显子。其中3例为L576P点突变：该突变中第1727位碱基C（胞嘧啶）替代了T（胸腺嘧啶），使其编码的亮氨酸（Leu）被脯氨酸（Pro）取代；1例为W557R点突变：该突变中第1669位碱基T（胸腺嘧啶）被C（胞嘧啶）替代，其编码的氨基酸由色氨酸（Trp）变为精氨酸（Arg）（图5）。c-kit基因13外显子及10例正常皮肤组织未见上述突变。

三、c-kit基因突变与临床特征之间的关系

图3 c-kit基因PCR扩增片段凝胶电泳图 11外显子：扩增产物长度为225 bp。M：标准参照物；1：正常皮肤组织；2～5：黏膜黑素瘤组织；6：阴性对照 图4 13外显子：扩增产物长度为193 bp。M：标准参照物；1：正常皮肤组织；2～4：黏膜黑素瘤组织；5：阴性对照

4例突变中，3例发生于直肠黏膜，1例见于尿道黏膜（表1）。直肠黏膜和其他黏膜部位c-kit基因突变率分别为3/7、1/24。8例淋巴结转移患者中检测到3例发生c-kit基因突变3/8，23例无淋巴结转移者中1例发生突变1/23。不同性别及年龄之间c-kit基因突变差异无统计学意义，均Pgt;0.05。

讨 论

黑素瘤是起源于表皮黑素细胞的一种高度恶性肿瘤。临床上倾向将其分为肢端型、黏膜型、慢性日光损伤型和非慢性日光损伤型［6］。黏膜黑素瘤的发病率在世界范围内相对较低，临床资料缺乏［7］。但在亚洲人群中，黏膜黑素瘤的患病人数仅次于肢端黑素瘤，位居第二［4］。国内［4，6，8］关于黑素瘤的研究报道较多，但大多集中于汉族人群，而维吾尔族黑素瘤的研究报道较少［9］，与c-kit基因相关研究报道更为少见。c-kit基因位于人染色体4q12，属于原癌基因，编码跨膜酪氨酸激酶受体，生理情况下与其配体干细胞因子（stem cell factor，SCF）结合后，触发下游的信号转导通路，调节细胞的增殖、分化等。突变后的c-kit基因可以不依赖于SCF而自动磷酸化，持续活化并激活下游的多条信号传导通路，导致肿瘤的发生和发展。2004年,Went等［10］首次在黑素瘤中发现c-kit基因突变，有研究表明，c-kit基因是黑素瘤中常见的致癌基因，该基因突变不仅与分子靶向治疗密切相关，而且认为是黑素瘤独立的预后不良因素［6，11-12］。

本研究结果显示,维吾尔族黏膜黑素瘤好发于老年患者；平均年龄为61.35岁，60～70岁为高发年龄段。这与国内汉族人群的年龄分布类似［6］，但与白种人相比［13］，本地区黏膜黑素瘤的发病有年轻化的趋势，这是否与环境因素改变有关，尚待进一步研究。本研究显示，维吾尔族黏膜黑素瘤在女性患者中更常见，推测发生这一现象的原因可能与泌尿生殖道系统来源的黑素瘤女性占绝大多数有关。头颈部是维吾尔族黏膜黑素瘤最常见的发病部位，其中又以鼻腔黏膜为主，其次为泌尿生殖道系统和直肠黏膜。初始症状常与其原发病灶相关，不同部位的出血如，便血、鼻出血等是患者就诊时最常见的症状。黏膜黑素瘤的发病部位隐匿，临床症状因发病部位不同而表现各异，加之早期缺乏特异性的临床特征，患者多于症状出现数月后才被诊断，极易导致误诊和漏诊。提示在临床诊疗行为中要提高对黏膜黑素瘤的认识，必要时结合组织病理学、免疫组化等相关检查明确诊断，尽量避免误诊和漏诊。

图5 c-kit基因突变类型测序图 5A：c-kit基因L576P正常基因型；5B：c-kit基因 L576P杂合突变（CTT→CCT）；5C：c-kit基因L576P纯合突变（CTT→CCT）；5D：c-kit基因 W557R正常基因型：5E：c-kit基因W557R杂合突变（TGG→CGG）

表1 c-kit基因突变患者临床资料

Went等［10］在黑素瘤中发现，c-kit基因 11 外显子L576P突变（T1727C），该突变导致膜旁结构域第576位亮氨酸被脯氨酸取代。随后的研究发现，黑素瘤中c-kit基因突变主要发生于11和13外显子，又以累及胞内近膜结构域的外显子11最常见［14］。突变位点最常见于11外显子的L576P（T1727C）突变，其次为W557R（T1669C），该突变位点也位于11外显子［14］。值得注意的是，不同黑素瘤亚型c-kit基因突变率不同，在黏膜黑素瘤中该基因突变率可达39%［11-12，15］。本研究 31 例患者中有 4 例发生 c-kit基因突变，突变率为12.9%。突变均位于11外显子，3例为L576P突变，1例为W557R突变，以杂合突变为主。这些突变位点在以往的研究中均有报道，且与国内汉族人群及白种人该基因常见突变位点及类型相一致［6，12］。另有报道显示，不同黏膜部位 c-kit基因突变率不同［15］。维吾尔族黏膜黑素瘤c-kit基因突变率在不同发病部位亦存在差异，直肠黏膜c-kit基因突变率明显高于其他黏膜部位，在本研究中高达 3/7。而 Omholt等［15］的研究结果表明，c-kit基因突变主要发生于外阴/阴道部位。提示黏膜黑素瘤c-kit基因突变的发生可能与地域、环境等因素有关。

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2014-09-19）

（本文编辑：吴晓初）

Mucosal melanoma:clinical assessment and mutation analysis of the c-kit gene in 31 Uygur patients

Chai Li*,Kang Xiaojing,Sun Zhenzhu,Gao Feng,Shi Xiaohui,Yu Shirong,Chen Wenjing,Wu Xiujuan,Ding Yuan,Liang Junqin,Liu Wenxian,Pu Xiongming.*Xinjiang Medical University,Urumqi 830001,China

Kang Xiaojing,Email：drkangxj666@163.com

ObjectiveTo analyze clinical characteristics of and c-kit gene mutations in Uygur patients with mucosal melanoma,and to explore the relationship between c-kit gene mutations and clinical characteristics of mucosal melanoma.MethodsClinical data were collected from 31 Uygur patients with pathologically confirmed mucosal melanoma.DNA was extracted from paraffin-embedded melanoma tissue samples from these patients.Then,PCR and direct DNA sequencing were performed to detect c-kit gene mutations.Statistical analysis was carried out by using Fisher′s exact test.ResultsOf the 31 Uygur patients,the male/female ratio was 1 ∶1.2,and the average age was 61.35 years.The incidence of mucosal melanoma was highest in the age group of 20-44 years,followed by the age group of 51-59 years.Head and neck,especially nasal mucosa,were the most common sites affected by mucosal melanoma,followed by genitourinary and rectal mucosa.C-kit gene mutations were detected in 4 （12.9%,4/31）out of the 31 mucosal melanoma cases,which were located in exon 11 and included L576P mutation in 3 cases and W557R mutation in 1 case.Of the 4 patients carrying C-kit gene mutations,3 had rectal mucosal melanoma and 1 urethral mucosal melanoma.The frequency of c-kit gene mutations was 3/7 in patients with rectal mucosal melanoma and 4.17%（1/24）in those with melanoma at the other mucosal sites.Additionally,the frequency of c-kit gene mutations was significantly higher in patients with lymph node metastasis than in those without（P=0.043）,but similar between male and female patients or between different age groups（bothP＞ 0.05）.ConclusionsMucosal melanoma mainly occurs in the elderly in Uygur population,with mucosa of the head and neck as the predilection sites.Mutations of the c-kit gene are closely associated with the site and lymph node metastasis of mucosal melanoma.

Melanoma;Mucous membrane;UYGUR NATIONALITY;Proto-oncogene proteins c-kit;Mutation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.006

乌鲁木齐市科学技术计划项目（G131310001）；2012年度留学人员回国创业项目

830001乌鲁木齐，新疆医科大学（柴莉）；新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科（康晓静、时晓辉、于世荣、陈文静、吴秀娟、丁媛、梁俊琴、刘文先、普雄明），病理科（孙振柱），消化科（高峰）

康晓静，Email：drkangxj666@163.com