整合素αvβ3、Survivin和Caspase-3在骨肉瘤组织中的表达及临床意义分析

王民，马照雨，王莹，刘建新，韩学哲

（西安交通大学第一附属医院骨外科，西安，710061）

骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤，该病多发生在青少年中，临床预后差。与其它恶性肿瘤一样，细胞增殖和细胞凋亡平衡的破坏可促使细胞的恶性转化，最终导致骨肉瘤的发生、发展。整合素αvβ3是细胞表面的重要黏附分子之一，在多种实体肿瘤细胞表面有高水平的表达。对细胞的黏附、增殖、分化、转移和凋亡有重要的调控作用；Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族的新成员，其选择性地表达于多种常见的恶性肿瘤，具有抑制细胞凋亡的功能[1]；Caspase-3被认为是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶，是细胞凋亡效应期的中心分子，参与细胞的生理及病理性死亡过程[2]。目前，αvβ3，Survivin和Caspase-3在骨肉瘤中的表达尚不清楚。本实验应用免疫组织化学方法研究30例骨肉瘤组织中αvβ3、Survivin和Caspase-3的表达情况并分析其与临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料2002～2013年在西安交通大学第一附属医院30例骨肉瘤标本及10例良性骨肿瘤标本。所有患者均经过临床、病理、影像学三者结合确诊。男17例，女13例，男女比例为1.3：1；年龄11～64岁，平均年龄20.95±9.47岁；股骨部位16例，胫排骨12例，其它部位2例；按Enneking外科分期Ⅰ期2例，ⅡA期7例，ⅡB期21例，Ⅲ期0。

1.2 试剂与仪器兔抗人整合素αvβ3多克隆抗体购自英国Abcam公司，Survivin和Caspase-3免抗人多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。兔超敏二步法免疫组化检测试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DAB试剂购自武汉博士德生物工程有限公司。石蜡切片机购自Thermo Shandon Ltd，型号为Finesse E。

1.3 免疫组化学染色组织经固定、脱水后进行石蜡包埋。石蜡切片机切10μm厚切片锚定到载玻片上。脱蜡水化后，3%H2O2去离子水孵育10Min，0.1%PBS洗涤2 min×3次。0.01 mmol构椽酸钠抗原修复液，微波炉内98℃加热10 min进行抗原修复。PBS洗涤2 min×3次。加入一抗（抗αvβ3 1：500，抗Survivin 1：200，抗Caspase-3 1：200），4℃孵育过夜，次日复温后PBS洗涤2 min×3次。加入抗兔IgG（1：200），37℃20 min，PBS洗涤2 min×3次。DAB显色，冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。

1.4 疗效判定每例标本随机选择10个高倍视野（X400）分别计数100个肿瘤细胞，计算染色阳性肿瘤细胞所占百分比，＜5%为阴性，＞5%为阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间比较采用卡方检验。

2 结果

2.1 αvβ3、Survivin和Caspase-3在骨肉瘤中的表达αvβ3（图1.A，B）、Survivin（图1.C，D）和Caspase-3（图1.E，F）表达定位于包膜或胞浆。整合素αvβ3在骨肉瘤组织中的阳性率为70%（21/30），明显高于骨纤维结构不良对照组0%（P＜0.001）。Survivin在骨肉瘤组织中阳性率为77%（23/30），在骨纤维结构不良对照组阳性率为10%（1/10）（P＜0.001）。Caspase-3在骨肉瘤组织中阳性率为47%（14/30），明显低于骨纤维结构不良对照组90%（9/10）（P＜0.05）。

图1 αvβ3、Survivin、Caspase-3在骨肉瘤和骨良性肿瘤组织中的表达A，C，E分别为αvβ3、Survivin、Caspase-3在骨肉瘤组织中的阳性表达；B，D分别显示αvβ3和Survivin在骨良性肿瘤组织中的阴性表达表达，F显示Caspase-3在骨良性肿瘤中的阳性表达。Scale barin F=50μm。

2.2 αvβ3、Survivin、Caspase-3的表达与临床病理特征的关系将30例骨肉瘤组织标本按Enneking分期分为Ⅰ～ⅡA和ⅡB～Ⅲ组，αvβ3、Survivin和Caspase-3的表达在两组之间有显著差异（P＜0.05）。而在不同年龄组、不同性别组及不同的发生部位组之间，αvβ3、Survivin和Caspase-3的表达无明显差异。

表1αvβ3、Survivin、Caspase-3的表达与骨肉瘤临床病理特征的关系

3 讨 论

整合素[3]是细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子，是细胞与细胞外基质联系的重要环节，可通过各种不同的信号途径，把细胞外的信号传入到细胞内，然后再通过下游信号通路传入细胞核，调节mRNA的转录和蛋白质的表达。整合素αvβ3又称玻璃体结合蛋白受体。研究表明，αvβ3在组织内的分布具有时相性和特异性，在成人血管、子宫平滑肌细胞等组织，αvβ3呈低水平表达，而在肿瘤新生血管及炎症组织的新生内皮细胞有高水平表达。一些浸润性肿瘤细胞，如骨肉瘤、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等也有αvβ3的表达[4]。而使用整合素αvβ3的拮抗剂可以诱导癌细胞的凋亡[5]。体外研究表明，抑制整合素αvβ3后，由血小板介导的肝癌细胞对血管内皮的粘附性会明显降低，表明在肿瘤转移的过程中整合素也起着非常重要的作用。大量研究表明整合素αvβ3对肿瘤新生血管也具有促进作用，通过抑制整合素可以明显减少肿瘤新生血管的产生，因此整合素αvβ3被认为是肿瘤治疗的新的靶点[6]。目前临床上采用的整合素αvβ3抑制剂虽然对某些神经胶质细胞瘤患者可以起到抑制作用，有学者认为这种作用是直接由于对肿瘤细胞的直接抑制[10，11]。但目前还没用明确的证据表明对其他类型的肿瘤也同样有效[7-9]。因此整合素在肿瘤中的功能及作用仍需进一步研究。Survivin选择性表达于肿瘤组织，而在正常分化成熟的组织中无表达，在肿瘤的发生、发展中起重要作用[12]。在整合素αvβ3和Survivin促进肿瘤细胞的增殖作用过程中，caspase-3均起到介导作用：αvβ3和Survivin有可能直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程。

本研究对30例骨肉瘤和10例骨纤维结构不良的研究发现，在骨肉瘤组织中整合素αvβ3和Survivin的阳性率均高于良性骨肿瘤组织，而Caspase-3的阳性率在骨肉瘤中则比良性肿瘤为低。提示整合素αvβ3和Survivin与Caspase-3相互作用促进骨肉瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡过程起到重要作用。进一步对患者的临床病例特征进行分析标明，αvβ3、Survivin和Caspase-3的表达仅与骨肉瘤Enneking外科分期相关，而在患者不同年龄组、不同性别组及不同的发生部位组之间，三者的表达无明显差异。这一研究结果进一步表明αvβ3、Survivin和Caspase-3可能参与肿瘤细胞的恶性生物学行为。

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