ACE基因单核苷酸多态性与冠心病易感性的关联性分析

吴 娟，贾一扬，刘 特，周丽婷，孙 迪，徐 缙，李春艳，王树越，于 雷，叶 琳

（1.吉林大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学中日联谊医院急诊科，吉林 长春 130033；3.吉林大学第二医院放疗科，吉林 长春 130041）

冠心病 （coronary heart disease，CHD）是一种原因尚不明确的心血管疾病，其危险因素主要包括遗传因素、年龄、性别、血脂异常、高血压、糖尿病、肥胖与超重、不良生活饮食习惯和精神压力等。CHD的形成涉及到遗传因素、环境因素及其交互作用，动脉粥样硬化是其病变的主要病理生理学机制［1－2］，在动脉粥样硬化的发生发展过程中肾素－血管 紧 张 素－醛 固 酮 系 统 （renin－angiotensinaldosterone system，RAAS）起着重要的作用［3］。RAAS是体内重要的内分泌系统，在血压及心血管稳态调节中占有重要的地位，其过度激活与CHD、充血性心力衰竭和高血压等疾病的发生、发展密切相关［4］。血管紧张素转换酶 （angiotensin converting enzyme，ACE）是RAAS系统中参与构成血管内皮细胞的一种金属肽酶，是ACE基因的表达产物［5－6］。目 前国内外 有关 ACE 基 因 与CHD相关性的研究多集中于ACE基因插入／缺失多态性 （I／D）［7－9］，关于 ACE 基因单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism，SNPs）与CHD关联性的研究少有报道。本研究拟通过病例对照研究，选取ACE基因rs4267385和rs4316位点，旨在探讨ACE基因与中国北方汉族人群CHD易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2009—2013年在吉林大学第一医院确诊并住院治疗的CHD患者246例作为病例组，研究对象临床表现及心电图变化均符合WHO制定的CHD诊断标准。对照组为同期在吉林大学第一医院体检中心体检的健康个体251名。个体间均无血缘关系且2组人群均为中国北方汉族人。

1.2 主要试剂和仪器 DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶引物、PCR引物、限制性内切酶、琼脂糖和DL 2000DNA Marker（Takara公司，日本），溴化乙锭 （大连宝生物工程有限公司）。离心机 （Eppendorf公司，德国），微量加样器（Gilson公司，美国），PCR扩增仪和紫外凝胶成像系统 （Bio－Rad公司，美国），电泳仪 （北京六一仪器厂），恒温培养箱 （上海贺德实验设备有限公司）。

1.3 基因组DNA的提取 在研究对象知情同意的情况下，抽取外周静脉血5mL，EDTA抗凝，－20℃冻存以备基因组DNA的提取。按照DNA提取试剂盒实验步骤从EDTA抗凝全血中提取DNA，采用紫外分光光度计检测DNA含量，A280／A260比值均在1.6～2.0。

1.4 SNPs的选择 在Hapmap数据库中查询中国北方汉族人群ACE基因的SNPs数据，运用Haploview 4.2软件对位点进行筛选，选取最小等位基因频率 （MAF）大于0.1、连锁不平衡系数 （r2）大于0.8、连锁不平衡程度随距离而改变的程度 （D′）为1的2个SNPs位点 （rs4267385和rs4316）作为研究位点，采用聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性 （PCR－RFLP）方法进行基因型检测。

1.5 基因型检测 引物设计：在NCBI的SNP库里查询ACE基因rs4267385和rs4316位点的模板序列，利用Primer 5.0软件设计引物。rs4267385，上游引物 5′－GGGAAGTGAGTCTGAGGG－3′，下游 引 物 5′－TGGAAGCCAGGTTATCTC－3′；rs4316，上 游 引 物 5′－CGGGCTCCGCTCTTATTG－3′， 下 游 引 物 5′－GGGCTCTGGGCTGATGTCT－3′。反应体系为20μL，含有2×Taq PCR MasterMix 10μL，上下游引物各2μL，二馏灭菌水 （ddH2O）4μL，模板DNA 2μL；反应条件：94℃ 预 变 性 5min；94℃、30s，58℃（rs4267385）／56℃ （rs4316）、30s，72℃、1min，34个循环；72℃延伸10min；4℃保存。酶切体系及反应条件：酶切体系为20μL，包含PCR扩增产物10μL，限制性内切酶 （rs4267385用PmlⅠ，rs4316用 Xsp Ⅰ）0.8μL，ddH2O 7.2μL，10×Buffer／10×Buffer TangoTM2μL。酶切体系在37℃恒温箱中酶切4～16h后，用2.5%琼脂糖凝胶电泳30min，凝胶成像分析系统观察酶切图谱，判断位点的基因型。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，采用拟合优度χ2检验分析病例组和对照组基因型频数分布是否符合Hardy－Weinberg平衡定律，采用χ2检验分析SNPs基因型、等位基因频数分布与CHD的关联性。

2 结 果

2.1 研究对象的基本情况 病例组共246例，其中男性130例，女性116例，平均年龄 （64.74±11.35）岁。对照组共251例，其中男性124例，女性127例，平均年龄 （62.39±12.16）岁。病例组与对照组研究对象年龄和性别比较差异均无统计学意义 （t年龄＝1.614，P＝0.205；χ2性别＝0.150，P＝0.904），说明病例组与对照组人群年龄和性别均匹配，具有可比性。

2.2 rs4267385和rs4316位点酶切电泳结果rs4267385位点带有C基因型被酶切成336和52bp 2个片段；带有T基因型不能被酶切，电泳时只有388bp片段；CT杂合子同时具有3个片段。rs4316位点带有T基因型被酶切成140和116bp 2个片段；而带有C基因型不能被酶切，电泳时只有256bp片段；CT杂合子同时具有3个片段。见图1。

2.3 Hardy－Weinberg平衡定律检测 采用拟合优度χ2检验对病例组和对照组rs4267385、rs4316位点的基因型频数分布进行Hardy－Weinberg平衡检验，结果显示：病例组和对照组研究对象2个位点基因型分布均符合 Hardy－Weinberg平衡定律（P＞0.05）。见表1。

2.4 病例组和对照组人群ACE基因rs4267385和rs4316位点的基因型和等位基因频数分布比较病例组和对照组rs4267385位点CC、CT和TT基因型频数分布比较差异均有统计学意义 （P＜0.05），OR （CC／CT）＝0.660 （95%CI：0.398～1.118）， OR （TT／CT） ＝ 1.402 （95%CI：0.954～2.052），OR （CC＋ TT／CT） ＝1.139（95%CI：0.798～1.626）；C、T等位基因频数分布比较差异有统计学意义 （P＜0.05），OR （C／T）＝0.640 （95%CI：0.495～0.827）。见表2。

图1 rs4267385（A）和rs4316（B）位点酶切电泳图Fig.1 Electrophoregram of digestion of rs4267385（A）and rs4316（B）sites

病例组和对照组rs4316位点CC、CT和TT基因型频数分布比较差异均无统计学意义 （P＞0.05）， OR （CC／CT） ＝ 0.926 （95%CI：0.581～1.475），OR （TT／CT）＝1.100（95%CI：0.717～1.686），OR （CC＋TT／CT）＝1.019（95%CI：0.715～1.454）；C、T等位基因频数分布比较差异无统计学意义（P＞0.05），OR （C／T）＝0.928 （95%CI：0.723～1.191）。见表3。

表1 2个SNPs位点Hardy－Weinberg平衡的拟合优度χ2检验结果Tab.1 Results ofχ2 test of Hardy－Weinberg equilibrium of two SNPs sites

3 讨 论

人体ACE基因位于染色体17q23，ACE对于心血管系统具有重要作用，主要使血管紧张素Ⅰ（AngiotensinⅠ，AngⅠ）转化为血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ），灭活缓激肽和调节血管张力。AngⅡ有缩血管的作用，且能诱导血管平滑肌细胞增生和肥厚，加强血小板衍生生长因子的表达及抑制纤溶活性，使低密度脂蛋白 （LDL）在血管壁内滞留、氧化并被巨噬细胞吞噬，促进血栓形成；而缓激肽能刺激内皮细胞释放舒张因子，抑制平滑肌细胞的增殖［10］。当ACE基因上某个碱基发生改变，可引起血管紧张素表达量或活性的改变，与冠心病和心肌梗死的发生发展密切相关。Sesal等［11］和 Dzielinska等［12］研 究 发 现：ACE 基因是欧洲人群中CHD的易感基因。YýLmaz等［13］对ACE基因I／D多态性与儿童CHD发病相关性进行研究发现：病例组人群D等位基因频数高于对照组。姜昕等［14］对中国居民ACE基因I／D多态性与CHD易感性关系进行了荟萃分析，结果发现：病例组人群DD基因型和D等位基因频数分布均高于对照组，DD基因型个体CHD发病风险高于ID型和II型，表明D等位基因与CHD发病风险密切相关。

表2 病例组和对照组人群rs4267385位点基因型和等位基因频数分布Tab.2 Distribution of genotypic and allelic frequencies at rs4267385site in case and control groups ［n （η／%）］

表3 病例组和对照组人群rs4316位点基因型和等位基因频数分布Tab.3 Distribution of genotypic frequencies and allelic frequencies at rs4316site in case and control groups［n（η／%）］

CHD是一种受多个遗传因素和环境因素共同作用的复杂疾病。Sun等［15］研究发现：ACE基因rs4332位点多态性与老年人冠心病发病有关。Ellis等［16］对ACE基因多态性与CHD易感性的研究发现：ACE基因rs4267385多态性与CHD发病有关。本研究采用病例－对照研究探讨ACE基因上2个SNPs与中国北方汉族人群CHD易感性的关系，结果显示：病例组和对照组人群rs4267385位点基因型和等位基因频数分布比较差异有统计学意义，OR （CC／CT）＝0.660、OR （TT／CT）＝1.402、OR （C／T）＝0.640，表明rs4267385位点多态性与中国北方汉族人群CHD易感性有关联，TT基因型个体CHD发病风险高于CC基因型和CT基因型个体，与Ellis等［16］研究结果一致。rs4267385位点多态性改变可能会导致ACE表达的差异，影响AngⅠ转化为AngⅡ的过程，从而导致心血管疾病易感性的差异。本研究发现：rs4316位点多态性与中国北方汉族人群CHD易感性无关联，可能是由于rs4316位点多态性与CHD易感性无关或本研究样本量较少，检验效能低的原故。在今后的研究中需进一步扩大样本量，同时检测与CHD发生可能相关的其他基因，进行基因与基因、基因与环境之间交互作用的分析。

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