纳米二氧化硅颗粒对HL－7702细胞黏附和迁移能力的影响

潘 涛，郭彩霞，金明华，刘晓梅，刘 颖，杜海英，孙志伟，4

（1.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，吉林 长春 130021；2.西安医学院公共卫生系，陕西 西安 710021；3.首都医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系，北京 100069；4.首都医科大学公共卫生学院卫生化学与毒理学系，北京 100069）

三维空间尺度中至少有一维处于纳米尺度范围的材料称为纳米材料，粒径为1～100nm的纳米颗粒、直径为1～100nm的纳米线和厚度为1～100nm的纳米薄膜均是纳米材料。近年来随着纳米技术的迅猛发展，工程化的纳米二氧化硅材料已经被广泛应用于生产生活的各个领域，人们通过呼吸、饮食、皮肤接触等途径接触到纳米二氧化硅材料的机会越来越多，其生物学安全性也受到广泛的关注［1］。目前大部分体外研究更多地关注于由纳米二氧化硅所引起的细胞毒性，然而在细胞的生长增殖未受到影响、细胞未发生死亡之前，某些特定的细胞功能 （如细胞的黏附、迁移和分化等）可能已发生改变，而常规的毒理学指标并不能有效地检测出这些变化［2］。本实验以人正常肝细胞株HL－7702为研究对象，探讨纳米二氧化硅颗粒对细胞黏附迁移的影响，旨在为更全面地评价纳米二氧化硅颗粒的生物安全性，建立更完善的安全性评价体系提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 纳米二氧化硅颗粒 （吉林大学化学院惠赠），RPMI－1640培养基 （Gibco公司，美国），胎牛血清 （天津灏洋生物公司），胰蛋白酶（DIFCO公司，美国），二甲基亚砜 （DMSO，沈阳市试剂五厂），麦氏胶 （Matrigel，Becton Dickinson公司，美国），其他试剂均为国产分析纯。透射电子显微镜 （transmission electron microscope，TEM）（JEOL公司，日本），激光粒度分析仪 （Beckman Coulter公司，美国），多功能酶标仪 （MDC公司，美国），光学显微镜（Olympus公司，日本）。

1.2 纳米二氧化硅颗粒的制备 在三颈瓶中加入100mL无水乙醇、4mL氨水、2mL水和5mL正硅酸乙酯，机械搅拌下于40℃水浴中反应12h，搅拌速度为150r·min－1；所得产物通过离心分离，离心转速13000r·min－1，离心时间20min，所得粒子用超纯水洗3次，并重新分散于100mL超纯水中。

1.3 TEM观察纳米二氧化硅颗粒的形貌和粒径分布 将纳米二氧化硅颗粒分散于无血清的RPMI－1640培养液中，浓度为200mg·L－1，放置24h后，采用TEM观察颗粒的形貌和分散性，Image－Pro－Plus软件计算平均粒径。

1.4 纳米二氧化硅颗粒在分散介质中的粒度分布 将纳米二氧化硅颗粒分别用含不同浓度血清 （0、1%、5%和10%）的RPMI－1640培养液稀释，放置24h后，用动态光散射法检测纳米二氧化硅颗粒水合粒径的大小，从而反映出纳米二氧化硅颗粒在分散介质中的粒度分布。

1.5 人正常肝细胞株HL－7702的培养 人正常肝细胞系HL－7702购自中国科学院上海细胞生物研究所，细胞培养于含15%胎牛血清的RPMI－1640培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中传代培养。

1.6 细胞黏附实验 用无血清RPMI－1640培养液配制 Matrigel（1∶8稀释）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，10g·L－1），以50μL／孔均匀涂布于96孔板中，4℃过夜，BSA为对照基底。弃去各孔上清，加入含10g·L－1BSA的无血清培养液进行封闭，50μL／孔，37℃、30min。取对数生长期细胞，以1×105mL－1接种于6孔培养板中，每孔2mL，并设空白对照孔（不加细胞，其他步骤与阴性对照组相同）。于37℃、体积分数为5%CO2条件下培养24h后，加入分散于无血清RPMI－1640培养液中的纳米二氧化硅颗粒，浓度分别为12.5、25.0、50.0和100.0mg·L－1，每孔2mL，对照组加无血清培养液2mL。培养24h后，温PBS洗3次，胰酶消化收集细胞，调整细胞浓度至1×105mL－1，接种于已包被Matrigel胶和BSA的96孔板中，每孔200μL，每组3复孔，继续培养2h后洗去未黏附细胞，按MTT比色法测定各孔细胞的吸光度 （A）值，根据A值计算相对黏附率。相对黏附率 （%）＝ （实验组A值－空白组A值）／（对照组A值－空白组A值）×100。

1.7 划痕修复实验 用无血清RPMI－1640培养液配制Matrigel（1∶8稀释），1mL／孔均匀涂布于6孔板中，4℃过夜。吸出残液，每孔加入1mL含10g·L－1BSA的无血清培养液进行封闭，37℃、30min。取对数生长期细胞，接种于已包被Matrigel的6孔板中，每孔2mL，每组3复孔，于37℃、5%CO2条件下培养至细胞基本融合，用200μL灭菌吸头在孔内划痕，选取拍照点，做好标记，光镜下拍照，测量出划痕宽度作为0时的细胞划痕宽度。弃掉培养液，PBS冲洗3遍，加入分散于无血清RPMI－1640培养液中的纳米二氧化硅 颗 粒， 浓 度 分 别 为 12.5、25.0 和50.0mg·L－1，对照组加入无血清 RPMI－1640培养液，每孔2mL，培养24h后，在划痕标记点处再次拍照，测量出划痕宽度作为24h的细胞划痕宽度。各标记点24h划痕宽度减去0时划痕宽度记为24h内细胞的迁移距离。损伤修复率 （%）＝迁移距离／0时细胞划痕宽度×100。

1.8 TEM观察细胞对纳米二氧化硅颗粒的摄取及颗粒在细胞内的分布 取对数生长期细胞，以1×105mL－1接种于6孔培养板中，每孔2mL。于37℃、5%CO2条件下培养24h后，加入含浓度为25.0mg·L－1纳米二氧化硅颗粒的无血清RPMI－1640培养液，每孔2mL，对照组加无血清培养液2mL。培养24h后，温PBS洗3次，胰酶消化细胞，1000r·min－1离心10min，弃上清。细胞用含有2.5%戊二醛和4%多聚甲醛的0.1mol·L－1PBS固定3h，PBS洗后，放入2%琼脂糖凝胶中，4%锇酸后固定1h，蒸馏水洗后，以醋酸双氧铀染色1h，梯度乙醇 （体积分数分别为30%、60%、70%、90%和100%）脱水，环氧树脂包埋，制作超薄切片，并以5%醋酸双氧铀和2%枸橼酸铅双重染色后，TEM观察。

1.9 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。各组细胞相对黏附率和损伤修复率以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 纳米二氧化硅颗粒的形貌 TEM结果显示：纳米二氧化硅呈圆形，颗粒大小均匀一致，分散性良好。应用Image Pro－Plus软件计算颗粒平均粒径为 （67.42±5.69）nm，属于纳米级颗粒。见图1。

图1 纳米二氧化硅颗粒的透射电镜图像（×50000）Fig.1 TEM image of SiO2nanoparticles（×50000）

2.2 纳米二氧化硅颗粒在含不同浓度血清的RPMI－1640培养液中的粒径 应用动态光散射法检测纳米二氧化硅颗粒在含不同浓度血清的RPMI－1640培养液中的粒度分布，结果显示：纳米二氧化硅颗粒在无血清RPMI－1640培养液中水合粒径为 （134.13±2.78）nm，而在含1%、5%和10%血清的RPMI－1640培养液中的水合粒径明显增大，分别为 （188.87±2.84）、 （170.23±2.00）和 （177.03±1.19）nm。

2.3 各组HL－7702细胞相对黏附率 经纳米二氧化硅颗粒作用24h后，随着作用浓度的增加，纳米颗粒对细胞黏附能力的抑制程度增强，呈一定的浓度依赖效应。当 HL－7702细胞暴露于浓度为12.5mg·L－1的纳米二氧化硅颗粒时，细胞的相对黏附率轻微下调，但与对照组比较差异无统计学意义 （P＞0.05），当纳米二氧化硅浓度上升至25.0、50.0和100.0mg·L－1时，相对黏附率分别下降至78.04%、70.66%和62.30%，与对照组比较差异均有统计学意义 （P＜0.05）。见表1。

表1 纳米二氧化硅颗粒作用24h后各组HL－7702细胞相对黏附率和损伤修复率Tab.1 Adhesion rates and healing rates of HL－7702cells after treated with SiO2nanoparticles for 24hin various groups （n＝3，，η／%）

表1 纳米二氧化硅颗粒作用24h后各组HL－7702细胞相对黏附率和损伤修复率Tab.1 Adhesion rates and healing rates of HL－7702cells after treated with SiO2nanoparticles for 24hin various groups （n＝3，，η／%）

＊ P＜0.05 vs control group.

Group Adhesion rate Healingrate Control 100.00±13.58 49.55±6.73 SiO2nanoparticles（mg·L－1）12.5 97.18±8.73 47.81±6.5425.0 78.04±2.39＊ 34.25±4.47＊50.0 70.66±5.34＊ 23.03±4.27＊100.0 62.30±2.94＊ —

2.4 各组HL－7702细胞损伤修复率 采用划痕修复实验检测纳米二氧化硅颗粒对细胞迁移能力的影响，因在100mg·L－1的作用剂量下，细胞单层破坏严重，划痕边缘已分辨不清，故本实验只选择12.5、25.0 和 50.0mg·L－13 个 染 毒 组。当HL－7702细胞暴露于纳米二氧化硅颗粒时，细胞的迁移能力可被抑制，并且随着作用浓度的增加，纳米颗粒对细胞迁移能力的抑制程度增强，呈浓度依赖效应。12.5mg·L－1纳米二氧化硅颗粒暴露组HL－7702细胞的损伤修复率稍有下降，但与对照组比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。25.0和50.0mg·L－1纳米二氧化硅颗粒暴露组 HL－7702细胞的迁移能力明显下降，损伤修复率分别下降至34.25%和23.03%，与对照组比较差异有统计学意义 （P＜0.05）。见表1。

2.5 HL－7702细胞对纳米二氧化硅颗粒的摄取及颗粒在细胞内的分布 TEM结果显示：对照组细胞呈椭圆形，表面布满了许多微绒毛；细胞核较大，呈椭圆形，核仁一个，较大明显；细胞质里可见粗面内质网，糖原颗粒等 （图2A）。24h后，25.0mg·L－1纳米二氧化硅颗粒暴露组 HL－7702细胞的亚结构未发生明显的损伤性改变，但大量的纳米颗粒已经被细胞摄取 （图2B）；可见细胞膜凹陷，包裹吞噬纳米颗粒的过程 （箭头处）（图2C）；颗粒以成簇的形式分布于内吞小泡中 （箭头处）；亦可见颗粒散在分布于胞质中，周围无膜结构包被（箭头处）（图2D）。

图2 TEM观察HL－7702细胞对纳米二氧化硅颗粒的摄取及颗粒在细胞内的分布Fig.2 Cellular uptake of SiO2nanoparticles in HL－7702cells and its distribution in cells observed with TEM

3 讨 论

颗粒物可通过调理作用被网状内皮系统如肝脏和脾脏摄取。有研究［3］证实：纳米二氧化硅颗粒易于在肝脏蓄积并引起病理性改变。本研究以人正常肝细胞株HL－7702为受试物，探究纳米二氧化硅颗粒对其黏附和迁移能力的影响。

纳米颗粒的粒径、形貌和分散性等特征对其生物学效应及毒性有很大影响［4］，因此纳米颗粒的表征是评价其生物学效应及毒性的重要参数［5］。本研究首先应用TEM和DLS对纳米二氧化硅颗粒进行表征，TEM结果显示：颗粒呈圆形，大小均一，分散性良好，其平均粒径为67.42nm，属纳米级颗粒；DLS结果显示：在含有不同浓度血清的培养液中，纳米颗粒的水合粒径均比在无血清培养液中的大，结果表明血清对于纳米颗粒的水合粒径有较大影响。为了避免血清对纳米二氧化硅粒径的影响，本研究选择分散于无血清RPMI－1640培养液中的纳米二氧化硅颗粒作为受试物。

细胞的黏附和迁移是动物细胞的基本的生命活动。细胞黏附通过一系列相关黏附分子的精密配合而完成，在细胞的存活、生长增殖、分化、组织的形成中均扮演重要角色［6］。细胞迁移也参与一系列生理和病理过程，在胚胎发育、伤口愈合、血管的再生和重塑及组织的形成等众多生理过程中起关键作用，在炎症反应和肿瘤转移等病理过程中也扮演重要角色［7］。有学者［2］认为：纳米颗粒能够通过不同的途径进入细胞或停留在细胞外基质中，除影响细胞的存活外，还可能会造成细胞的黏附迁移、分化等生理功能的改变，而这些细胞功能的改变却不能通过经典常用的毒理学方法 （例如MTT和LDH活力实验）来检测。本研究采用细胞黏附实验和划痕修复对细胞的黏附迁移进行了检测，结果表明：当HL－7702细胞暴露于纳米二氧化硅颗粒时，颗粒能够对细胞的黏附迁移产生抑制作用，并且随着作用浓度的增加，纳米颗粒对细胞黏附迁移能力的抑制程度增强，呈一定的浓度依赖效应。值得注意的是，根据本组前期的研究结果［8］，纳米二氧化硅颗粒在25mg·L－1的作用剂量下并不能对HL－7702细胞产生毒性作用，但在此剂量下却能明显抑制HL－7702细胞的黏附和迁移能力，结果表明：纳米二氧化硅颗粒对细胞黏附和迁移造成的影响发生在细胞存活受抑制、细胞膜受损之前。

为了避免因细胞膜损伤而致使纳米二氧化硅颗粒被动地进入细胞，本研究选用无毒剂量（25.0mg·L－1）来观察细胞对纳米二氧化硅颗粒的摄取及颗粒在细胞内的分布，TEM结果表明：在25.0mg·L－1作用剂量下，细胞已能大量摄取纳米二氧化硅颗粒，颗粒主要已呈簇的方式蓄积于内吞泡中，同时细胞膜凹陷、包裹吞噬纳米颗粒的过程可被捕捉到，而散在分布、周围无膜包被的颗粒可能由于内吞泡破裂进而释放到胞质中［9］。研究［10］表明：细胞摄取纳米颗粒最常见的方式是通过细胞内吞，此过程包括细胞膜凹陷，进而包裹吞噬纳米颗粒。由此推测本研究中HL－7702细胞也是通过内吞的方式摄取纳米二氧化硅颗粒。细胞骨架系统在细胞内吞过程中起重要作用，内吞的发生需要肌动蛋白细胞骨架的重组，在细胞通过内吞方式大量摄取纳米颗粒的过程中，细胞骨架可能会受到损伤而导致骨架结构紊乱［11］，而细胞骨架系统与细胞黏附和迁移有密切关系。在本研究中，当无毒剂量 （25mg·L－1）的纳米二氧化硅颗粒作用于细胞时，细胞的存活没有受到影响、细胞膜未发生明显的损伤［8］，然而大量的颗粒却已进入细胞并且对细胞的黏附和迁移均产生了影响，其原因可能是当HL－7702细胞通过内吞方式大量摄取纳米二氧化硅颗粒时，细胞骨架发生了损伤，进而导致细胞黏附和迁移能力下调。也有研究者［2］认为：纳米二氧化硅颗粒可能通过影响FAK信号通路，抑制Src、PI3K和AKT激酶活性，从而抑制细胞的黏附和迁移，具体的作用机制还有待于进一步研究。

综上所述，纳米二氧化硅颗粒能够抑制HL－7702细胞的黏附和迁移能力，并呈一定的浓度依赖效应。本研究为进一步探讨纳米二氧化硅颗粒的毒性提供了实验基础，为纳米材料的安全性评价提供了新思路。

［1］Li Y，Sun L，Jin MH，et al.Size－dependent cytotoxicity of amorphous silica nanoparticles in human hepatoma HepG2cells［J］.Toxicol In Vitro，2011，25 （7）：1343－1352.

［2］Wang B，Chen D，Guo W，et al.Silica nanoparticles suppress fibronectin－mediated adhesion and migration in normal human keratinocytes ［J］.J Nanosci Nanotechnol，2012，12 （1）：293－299.

［3］Xie GP，Sun J，Zhong GR，et al.Biodistribution and toxicity of intravenously administered silica nanoparticles in mice［J］.Arch Toxicol，2010，84 （3）：183－190.

［4］Passagne I，Morille M，Rousset M，et al.Implication of oxidative stress in size－dependent toxicity of silica nanoparticles in kidney cells ［J］.Toxicology，2012，299 （2／3）：112－124.

［5］Sun L，Li Y，Liu XM，et al.Cytotoxicity and mitochondrial damage caused by silica nanoparticles［J］.Toxicol In Vitro，2011，25 （8）：1619－1629.

［6］Zhang YY，Hu L，Yu DH，et al.Influence of silica particle internalization on adhesion and migration of human dermal fibroblasts［J］.Biomaterials，2010，31 （32）：8465－8474.

［7］Cao Z，Saravanan C，Chen WS，et al.Examination of the role of galectins in cell migration and re－epithelialization of wounds［J］.Methods Mol Biol，2015，1207：317－326.

［8］潘 涛，金明华，刘晓梅，等.纳米SiO2颗粒对HL－7702细胞的毒性作用和缝隙连接通讯的影响 ［J］.吉林大学学报：医学版，2013，39 （2）：222－226.

［9］Faklaris O， Joshi V， Irinopoulou T， et al.Photoluminescent diamond nanoparticles for cell labeling：study of the uptake mechanism in mammalian cells［J］.ACS Nano，2009，3 （12）：3955－3962.

［10］Ng CT， Tang FM， Li JJ， et al. Clathrin－mediated endocytosis of gold nanoparticles in vitro ［J］.Anat Rec（Hoboken），2014，298 （2）：418－427.

［11］Huang XL，Teng X，Chen D，et al.The effect of the shape of mesoporous silica nanoparticles on cellular uptake and cell function［J］.Biomaterials，2010，31 （3）：438－448.