肝细胞生长因子和血管紧张素Ⅱ对肾小管上皮细胞转分化的影响及其作用机制

王红月，王 茉，张 晨，齐宏欣，迟宝荣

（1.吉林大学第一医院肾内科，吉林 长春 130021；2.吉林大学药学院再生医学系，吉林 长春 130021；3.吉林大学第一医院肝胆胰内科，吉林 长春 130021）

肝细胞生长因子 （hepatocyte growth factor，HGF）是一种重要的抗纤维化因子，具有抗肝纤维化作用［1］。近年来研究［2］显示：HGF也有抗肾纤维化作用，但其抗肾间质纤维化的作用机制目前尚不完全清楚。近年来研究［3－4］表明：HGF可通过抗肾小管上皮－肌成纤维细胞转分化 （tubular epithelial－myofibroblast transdifferentiation，TEMT）而防止肾脏纤维化，TEMT被认为是导致肾间质纤维化的重要原因。近期研究［5－7］发现：血管紧张素Ⅱ （angiotensinⅡ，AngⅡ）也是很强的致TEMT因子，且HGF与血管紧张素转化酶抑制剂联合有更好抗的TEMT作用，但关于HGF和AngⅡ对TEMT的影响及是否存在相关性尚无确切报道，本课题组主要针对HGF和AngⅡ与TEMT的关系进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 人肾近曲小管上皮细胞（human kidney proximaltubular cells－2， HK－2）购自中国生命科学院上海细胞库。RPMI－1640和胎牛血清 （美国 Gibco公司），CK－8试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒 （碧云天生物有限公司），α－平滑肌肌动蛋白 （α－SMA）抗体及二抗 （美国Santa Cruz），RT－PCR试剂盒 （日本 Takara公司）。

1.2 HK－2细胞培养HK－2细胞用含有10%RPMI－1640胎牛血清的培养液培养。在含10% 胎牛血清100U·mL－1青霉素和100mg·L－1链霉素的RPMI－1640培养基中传代培养。将 HK－2细胞按1×106接种在75cm2Flask培养瓶中，培养条件为37℃、5%CO2，当贴壁细胞达80%～90%融合时用无血清培养基洗3次，进行传代或种板，取Ⅳ期细胞进行实验。

1.3 细胞分组及CCK8法检测 以每孔1×103细胞接种于96孔板中，接种后6h加入刺激物，按加入刺激物的不同将HK－2细胞分对照组、AngⅡ组、HGF组和AngⅡ＋HGF组，每组3复孔。对照组只加HK－2细胞，HGF和AngⅡ组在细胞的基础上分别加入8μg·L－1HGF 和1×10－6mol·L－1AngⅡ，AngⅡ＋HGF组在细胞基础上同时加8μg·L－1HGF和1×10－6mol·L－1AngⅡ。24h后收集细胞，每孔加入10μL CCK8，37℃孵育1h后，检测450nm处吸光度 （A）值。以A值表示细胞增殖活性。

1.4 RT－PCR法检测 HK－2细胞中α－SMA mRNA表达水平 采用Trizol法提取总RNA，检测mRNA浓度，逆转录合成cDNA。PCR扩增α－SMA基因，β－actin为内参。α－SMA，正义链5′－ACTGGGACGACTAGGAAAAAG－3′， 反 义 链5′－CATCTCCAGAGTCCAGCACA－3′。 β－actin，正 义 链 5′－ATCATGTTTGAGACCTTCAACAC－3′，反义链 5′－CATGGTGGTGCCGCCAGACAG－3′。PCR扩增体系：cDNA模板2μL，去离子水14.5μL，10× PCR 缓 冲 液 2.5 μL，dNTP（2.5mmol·L－1）2μL，MgCl2（25mmol·L－1）1.5μL，上游引物 （50μmol·L－1）1μL，下游引物 （50μmol·L－1）1μL，ExTaqDNA聚合酶（5U·μL－1）0.5μL，总体积25μL。PCR扩增反应条件：94℃、5min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用Phoretix ID凝胶图像分析软件测定电泳条带的灰度值，用内参校准，以α－SMA／β－actin灰度值比值表示α－SMA mRNA表达水平。

1.5 Western blotting法检测 HK－2细胞中α－SMA蛋白表达水平 将细胞加入细胞裂解缓冲液，离心，提取总蛋白。取总蛋白50μg作SDS－PAGE电泳，凝胶浓度为10%，浓缩胶电压110V，电泳30min，分离胶电压100V，电泳90min。电泳结束后，用电转印仪将蛋白转移到PVDF膜上，时间60min，电流等于胶面积 （cm2）×0.55mA。PVDF膜用Blocking buffer（5% 脱脂奶粉）封闭4℃过夜。次晨，室温1h，TBST［20mmol·L－1Tris－HCl（pH7.4），0.15mol·L－1NaCl，0.1%Tween］洗3次，加入α－SMA兔抗人多克隆抗体（1∶500）室温孵育2h，TBST洗3次，加入辣根过氧化物酶交联的羊抗兔IgG二抗 （1∶2000）1h，TBST洗3次，加入免疫印迹化学ECL发光试剂，暗室曝光显影。用凝胶图像分析系统扫描分析条带的面积和灰度，蛋白区带用积分灰度值表示，同时检测β－actin的蛋白表达作为对照，其比值表示α－SMA蛋白表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。细胞增殖活性、α－SMA mRNA和蛋白表达水平均以表示，组间比较采用单因素方差分析。检验水准α＝0.05。

2 结 果

2.1 各组 HK－2细胞的增殖活性 与对照组（0.668±0.030）比 较，HGF 组细胞增 殖 活 性（0.737±0.051）升高 （P＜0.05），AngⅡ组和AngⅡ＋HGF组细胞增殖活性 （0.235±0.015和0.466±0.023）降低 （P＜0.05）；与 AngⅡ组比较，AngⅡ＋HGF组细胞增殖活性升高 （P＜0.05）。

2.2 各组 HK－2细胞中α－SMA mRNA 表达水平与对照组比较，HGF组和AngⅡ＋HGF组细胞中α－SMA mRNA表达水平降低 （P＜0.05或P＜0.01），AngⅡ组细胞中α－SMA mRNA表达水平升高 （P＜0.05）。与AngⅡ 组比较，AngⅡ＋HGF组细胞中α－SMA mRNA表达水平降低（P＜0.05）。见图1和表1。

2.3 各组HK－2细胞中α－SMA蛋白表达水平 与对照组比较，HGF组细胞中α－SMA蛋白表达水平降低 （P＜0.05），AngⅡ组和 AngⅡ＋HGF组细胞α－SMA蛋白表达水平升高 （P＜0.05或P＜0.01）。与AngⅡ 组比较，AngⅡ＋HGF组细胞α－SMA蛋白表达水平降低 （P＜0.05）。见图2和表1。

3 讨 论

图1 各组HK－2细胞中α－SMA mRNA表达电泳图Fig.1 Electrophoregram ofα－SMA mRNA expressions in HK－2cells in various groups

表1 各组HK－2细胞中α－SMA mRNA和蛋白表达水平Tab.1 Expression levels ofα－SMA mRNA and protein in HK－2cells in various groups （n＝3，）

表1 各组HK－2细胞中α－SMA mRNA和蛋白表达水平Tab.1 Expression levels ofα－SMA mRNA and protein in HK－2cells in various groups （n＝3，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs control group；△P＜0.05 vs AngⅡgroup.

Group α－SMA mRNA Protein Control 210±30 199±25 AngⅡ 270±15＊ 796±55＊＊HGF 120±41＊＊ 119±11＊AngⅡ＋HGF 150±23＊△ 398±23＊△

图2 各组HK－2细胞中α－SMA蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram ofα－SMA protein expressions in HK－2cells in various groups

HGF是一种非组织特异性生长因子，是目前已知生物活性最广泛的生长因子之一，其可以刺激多种上皮细胞和内皮细胞进行有丝分裂、运动以及小管形态的发生［8］。HGF作为一种有效的、拮抗纤维化形成的内源性因子，已经被用于治疗肾纤维化的实验及临床研究中［9］。肾小管上皮细胞在某种刺激下激活，可表达α－SMA，显示出肌成纤维细胞的形态，增殖能力加强，并产生大量间质基质成分，这一过程称为TEMT。TEMT被认为是一个相互协作、调节精准的过程，包括4个重要步骤：①肾小管上皮细胞丧失细胞－细胞间连接，发生TEMT的早期，E－钙黏蛋白的表达受抑；②α－SMA再表达和肌动蛋白重组，利于转化细胞迁移、侵袭、甚至获得收缩能力，可以作为TEMT的标志；③小管基底膜分裂破坏；④细胞迁移入侵能力增强。目前研究TEMT多以α－SMA为标志。近期的研究结果［4］提示：肾间质纤维化很大程度上是由于TEMT引起的，因此研究能够抑制TEMT的物质对防治肾间质纤维化至关重要。国内外的研究［10］及本课题组研究结果［3］显示：HGF有逆转TEMT的作用，但关于其具体机制尚在探讨中，多数学者认为其主要是通过对TGF－β1的抑制而实现的，目前有些研究［7，11－12］已显示：HGF与AngⅡ的关系不容忽视。AngⅡ也是很强的致TEMT因子，前期的实验研究证实HGF与血管紧张素转换酶抑制剂盐酸贝纳普利 （洛汀新）合用较单独应用HGF或洛汀新可更进一步减轻肾间质纤维化，二者有协同作用。而洛汀新的肾脏保护作用主要是由对AngⅡ的抑制作用而实现的，提示HGF亦可抑制AngⅡ，故两者合用作用增强，或通过其他途径放大了洛汀新抑制AngⅡ的作用。

本研究结果显示：与对照组比较，HGF组α－SMA mRNA和蛋白表达水平降低，促进肾小管上皮细胞增生，而AngⅡ组α－SMA mRNA和蛋白的表达增多，抑制肾小管上皮细胞增生，说明HGF不但可以促进肾小管上皮细胞增生，而且可以从基因及蛋白水平上抑制肾小管上皮细胞α－SMA的表达，即可抑制TEMT；而AngⅡ可抑制细胞增生，促进α－SMA的表达，促进TEMT，两者作用相反。与单独应用AngⅡ对比，同时加入HGF和AngⅡ时，肾小管上皮细胞增生明显，α－SMA的 mRNA及蛋白表达减少，即 HGF对AngⅡ抑制细胞增生及促进TEMT方面有逆转作用。本研究结果进一步扩充了HGF的作用机制，但在信号转导方面需要深入探讨。

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