机械灌注技术在临床肝移植的应用

【作者】任冯刚，朱皓阳，严小鹏，刘畅，张晓刚，吕毅

1 西安交通大学第一附属医院 肝胆外科，西安市，710061

2 西安交通大学先进外科技术与工程研究所，西安市，710061

3 陕西省再生医学与外科工程技术研究中心，西安市，710061

机械灌注技术在临床肝移植的应用

【作者】任冯刚1,2,3，朱皓阳1,2,3，严小鹏1,2,3，刘畅1,2,3，张晓刚1,2,3，吕毅1,2,3

1 西安交通大学第一附属医院 肝胆外科，西安市，710061

2 西安交通大学先进外科技术与工程研究所，西安市，710061

3 陕西省再生医学与外科工程技术研究中心，西安市，710061

肝移植是当前治疗终末期肝病唯一的有效手段。近年来为解决供体短缺问题，边缘供体被大量应用，随之也带来一系列问题。机械灌注技术可以模拟在体条件下肝脏生理循环状态，有利于离体肝脏保护，减少术后并发症的风险，是近年来器官保存的研究热点。该文就当前应用于临床肝移植的机械灌注技术现状及前景进行综述分析。

肝移植；器官保存；机械灌注

0　引言

肝移植是治疗终末期肝病唯一的有效手段。自上世纪六十年代以来，临床肝移植得到迅猛发展，从器官获取、离体保存到围手术期管理都取得了长足进步[1]。一直以来，单纯低温保存（Simple C°ld St°rage, SCS）是肝脏保存的金标准，可以在一定程度上延长供体器官寿命[1-2]。随着扩大标准供体（Extended Criteria D°n°r, ECD）的大量应用，传统保存方式已经无法满足器官保存的需要[3–6]。机械灌注（Machine Perfusi°n, MP）技术早在上世纪三十年代就被人提出，近十年来又逐渐引起人们重视，并已在肾脏保存领域得到广泛应用[1,3-4]。目前应用于临床肝移植的机械灌注技术尚未成熟，国外虽已有众多肝脏机械灌注方案，但都仍处于临床试验阶段，尚未大规模应用[2,5]。已有可靠的研究证实应用机械灌注对离体肝脏进行保存可以有效扩大供体池，降低术后并发症的发生率[5, 7]。

1　机械灌注技术及设备

机械灌注是指在器官离体后通过带有转动泵、控温装置、控压装置、氧合装置及计算机控制装置的设备用离体保存液或灌注液进行体外循环灌注的一项器官保存技术[2]。早在1935年，Carrel A就在实验室完成了近900例机械灌注实验，尽管大部分都是比较小的人体组织，但其所采用的方法已经与当代所用机械灌注方法类似：循环灌注，氧合渗透及压力控制[8-9]。原始Lindbergh–Carrel灌注泵实物见图1。在1968年，Belzer FO首次使用低温机械灌注设备成功将人类肾脏保存期延长至17 h[10]。

图1　原始Lindbergh–Carrel灌注泵实物[8]Fig.1 The °riginal Lindbergh–Carrel perfusi°n pump[8]

在2000年之前，机械灌注并未引起人们太多重视，一方面因为机械灌注对于设备技术要求较高，而单纯低温冷冻保存因为器官保存液的发展日渐成熟，也相对便宜；另一方面，脑死亡供体(D°n°r after Brain Death, DBD)取代心脏死亡供体(D°n°r after Cardiac Death, DCD)成为供体的主要来源，而低温保存液对于DBD供体保存效果相对较好[9,11]。近十年来，边缘供体特别是DCD供体又更多应用于器官移植，机械灌注技术才逐渐引起人们重视[1,2,9,11]。2009年，Pl°eg RJ教授[3]团队首次通过一项包含336对多来源肾脏的随机对照试验证实，低温机械灌注相对于单纯低温保存可以有效降低肾移植术后一年移植肾功能延迟恢复（Delayed Graft Functi°n, DGF）发生率，同时提高移植物存活率。自此，机械灌注逐渐广泛应用于肾脏移植领域，类似于LifeP°rt这样的离体肾脏机械灌注设备已经得到成功的商业化推广[1,3-4]。在2014年，Guarrera JV教授[5]团队首次完成了肝脏机械灌注保存的随机对照研究，这项研究中证实低温机械灌注可以有效降低早期移植物失功能（Early All°graft Dysfuncti°n, EAD）的发生。LifeP°rt肾脏器官保存转运系统实物和肝脏机械灌注系统原型机见图2。

图2　肾脏器官保存转运系统和肝脏机械灌注系统Fig.2 Kidney transp°rter f°r °rgan rec°very systems and the pr°t°type °f liver machine perfusi°n system

机械灌注设备在设计及制造上并不复杂。类似于临床上使用的血液透析设备及血浆置换设备，他们都是通过体外装置模拟人体内的循环流动，从而为离体器官供给所需的能量并清除循环废物。设备的核心元件主要是转动泵、控温装置、控压装置、氧合装置及计算机控制装置，关键问题是设定合适的运行参数以最大化满足肝脏在离体条件下的需求，这也是目前临床肝移植机械灌注争论的焦点[2,6]。根据肝脏的解剖特点，有两路管路分别连接肝脏动脉及门脉系统，同时还有一路管路对胆汁进行引流。氧合装置对入路液体进行充分氧合，以使足够的氧气渗透进灌注液以满足肝脏代谢；控温装置设定不同的环境温度，使离体循环稳定在恒温状态；计算机控制装置通过设定不同的温度、流速、灌注压力等参数来整体控制机械灌注的进行。

2　特点及分类

由于单纯低温保存技术存在诸多限制，特别是无法实时评价肝脏生理状态，对边缘供肝保存能力的缺乏，使之成为制约肝移植进一步发展的瓶颈。机械灌注则可以有效克服目前单纯低温保存无法解决的一些问题，它具备以下特点[2]：(1) 可以提供连续的循环灌注，保持肝脏微循环稳态；(2) 提供连续的氧气及营养物质以满足器官代谢；(3) 通过灌注液实时评估器官功能状态；(4) 引出的灌注液经滤过后可以移除代谢废物；(5) 通过灌注液注入细胞保护物质及药物等；(6) 提高移植物存活率及改善预后。

目前临床肝脏机械灌注方案较多，国外已有数家机构通过动物研究及小规模临床试验证实了其可靠性，但尚缺一个能被广泛认可的方案。不同方案之间主要区别点在于机械灌注的环境温度及介入时机的选择。根据环境温度的不同，机械灌注可分为低温机械灌注、常温机械灌注及亚低温机械灌注。同时，灌注液的组分和类型也尚存争议，灌注液的选择也决定于灌注温度条件。不同的灌注温度选择主要依据于细胞呼吸代谢曲线，单纯低温保存也正是基于这个原理设计，在0～4°C条件下细胞代谢率可以降低至正常生理状态的5%，从而延长器官寿命[12-14]。

在低温条件下，肝脏代谢活性最低，所需氧气最少，可以最大程度使细胞进入休眠状态，从而延长器官寿命[13]。但有学者认为低温环境并不利于细胞功能的保护，从而提出完全模拟在体状态的常温机械灌注，这样的条件下肝脏处于正常生理代谢状态，需要持续的氧气及营养物质的供应以满足需要，同时肝脏代谢产物也需要及时分离[15-16]。亚低温机械灌注是近来兴起的新的概念，他综合了低温和常温机械灌注的特点，可以保证肝脏在近似正常的生理活动的同时延长器官保存时间[17-19]。器官保存包括器官获取、转运、移植前再灌注三个阶段，在这三个阶段内机械灌注都可以进行介入，可以是在器官保存期全程进行灌注保存，也可以是其中一个阶段。不同灌注时机的选择及灌注时长之间的优劣目前暂无定论，但都被证实对于器官保存具有一定的作用。

3　低温机械灌注

低温机械灌注(Hyp°thermic Machine Perfusi°n, HMP)是目前最为成熟的机械灌注方案，并已在肾移植领域广泛应用[3-4]。HMP继承了单纯低温保存在0～10°C对器官进行保存的特点，具备很好的安全性，一旦机械灌注设备失常，离体器官仍可以在传统的低温下得到妥善保存[6,9]。在低温条件下器官代谢率较低，可以不需要供氧或其他能量物质，所以在灌注液的选择上空间更大，可以选用不含红细胞组分或携氧组分的灌注液。但这也同时限制了对离体肝脏功能状态的评估，特别是无法评估胆汁的生成[9,11]。

在2009年，Guarrera JV教授[20]团队开始了第一个应用于临床肝移植的HMP研究。在这项研究中，20例成人接受了经过3～7 h机械灌注后的肝脏移植，并与SCS组进行对比。结果显示：HMP组EAD发生率为5%，SCS组为25%。HMP在这项预实验中表现出较高的安全性和可靠性。在随后的5年里，该研究团队进行了目前开始最早，同时也是唯一已经完成的针对临床肝脏机械灌注保存的随机对照研究[5]。最终的结果显示：HMP组EAD发生率为19%，SCS组为30%（P=0.384）；1年术后生存率分别为85%和80%（无统计学差异）；但术后胆道并发症发病率HMP组明显低于SCS组（4 vs 13，P=0.016），术后住院日HMP组也明显低于SCS组（13.64±10.9 vs 20.14±11.12，P=0.001）。虽然这项研究仅容纳了30对患者，但却证实了HMP对于肝脏可靠的保护功能，以及可以降低术后胆道并发症的优势。

Dutk°wski P教授[7]团队则首次证实了机械灌注对于DCD供肝的保护作用。在这项研究中，DCD供体肝脏首先经过常规的4°C低温保存，随后在移植前1～2 h经门静脉进行低温氧合机械灌注，这项方案也被成为HOPE方案(Hyp°thermic Oxygenated Perfusi°n，HOPE)，基于荷兰OrganAssist系列的ECOPS系统。OrganAssist生产的LiverAssist肝脏灌注系统和体外器官获取系统见图3。这项研究证实经过机械灌注保存后DCD供体肝脏在肝脏功能、肾脏功能、住院日及术后并发症方面都与DBD供体表现相当。这项研究对于扩大标准供体的应用意义重大，虽然还缺乏进一步大样本的随机对照临床试验，但目前的结果已足够让人兴奋[6-7]。

图3　肝脏灌注系统和体外器官获取系统Fig.3 Liver perfusi°n system and extra c°rp°ral °rgan pr°curement system

4　常温机械灌注

常温机械灌注（N°rm°thermic Machine Perfusi°n, NMP）则是基于模拟正常体温（37°C）状态下进行肝脏灌注保存的方式。在这个条件下肝脏处于与在体环境类似的代谢状态下，肝脏正常生理活动不受中断，因此可以通过灌注液生化分析评估肝脏功能，是较为理想的保存方式。但这也增加了器官保存失败的风险，一旦灌注设备失效，器官将完全暴露于热缺血状态[15-16]。同时，NMP也对灌注液提出了较高的要求：一方面要满足代谢需求，持续供给氧气及能量物质，另一方面也要有足够能力清除代谢废物。在一些动物实验中，NMP已被证实对于胆管系统的保护具有明显优势。在常温条件下，肝脏可以正常生产胆汁，通过胆汁可以有效预测肝脏功能[15-16]。OrganOx Metra®常温肝脏机械灌注系统见图4。

图4　常温肝脏机械灌注系统Fig.4 N°rm°thermic liver perfusi°n system

已经有一项基于NMP方案的临床随机对照试验在进行中，Friend P教授带领的多中心移植团队计划招募260名移植患者，随机分配进入NMP组和SCS组，在这项研究中使用OrganOx机械灌注系统，预期评估指标包括早期肝脏功能、生存率及术后血生化指标等，预计将于2017年结束[6]（http://www.c°ntr°lledtrials.c°m/ISRCTN39731134）。

5　亚低温机械灌注

亚低温机械灌注(Subn°rm°thermic Machine Perfusi°n, SNMP)则是介于低温与常温之间的一种灌注方式，环境温度设定于20～30°C。SNMP突出的优势是在对氧气及能量要求相对较低的条件下评估肝脏功能。目前SNMP的应用还限于动物实验，Selzner1 M教授[17]团队通过离体猪肝亚低温机械灌注证实其可以有效保护胆管及胆管上皮细胞，减少保存期损伤。Izamis ML教授团队则通过对7例废弃人肝脏进行SNMP保存，最后证实SNMP可以有效保护肝功能、减少细胞损伤，并且在一定程度上有利于肝脏及胆道缺血后的恢复[19]。

6　机遇与前景

器官短缺一直是世界范围内制约移植发展的关键问题。近年来扩大标准供体概念的引入使得诸多边缘供体得到应用，同时也带来了一些新的问题，比如升高了移植失败的可能，较高的术后并发症发病率[21]。机械灌注技术的引入为边缘供体的优化使用带来可能[11]。

胆道病变是移植术后最严重的并发症之一，被认为是肝移植的“阿克琉斯之踵”。胆道并发症发生的病因很多，器官保存期对于胆道系统上皮细胞再生能力的保护缺乏是其主要原因之一。已有研究表明机械灌注技术可以对胆管周围血管丛及胆管周围腺体进行有效保护，从而保存了胆管细胞的再生能力[22]。P°rte JR教授[23]团队通过对9对猪DCD供肝模型进行氧合HMP研究，结果表明氧合HMP可以有效保护胆管周围血管束，避免小动脉坏死，再灌注后HMP组具有明显较高的动脉血流。Dutk°wski P[9]则应用HOPE方案于大鼠，同样证实机械灌注可以避免胆道损伤。在Guarrera JV[5]团队的临床研究中证实，HMP条件下保存的ECD供体术后胆道并发症发病率明显低于SCS组。

脂肪肝在边缘供体中占有很大比例，很多脂肪肝因为担心术后移植物丢失而被弃用。van Gulik教授[24]团队将HMP应用于脂肪肝供体中，取得了令人满意的结果。机械灌注技术可以同时引入治疗性药物是其很大的优势。通过在灌注时注入细胞保护物质可以很大程度上保护供体稳态。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC）被认为具有抗炎及促进再生的作用，机械灌注为间充质干细胞在肝脏移植的应用提供了一个良好的途径[6,15]。

灌注液是机械灌注的关键部分。灌注液的组分决定于灌注温度、灌注时间等因素。传统的器官保存液，如UW液，HTK液及Celsi°r液都是针对低温冷冻保存条件设计的，目前一部分机械灌注方案中应用的灌注液都是基于上述液体改良，加入营养物质、携氧物质（血液或人造血液）、抗生素、血管活性药物等。虽然这些灌注液在不同方案下可以对肝脏起到一定保护作用，但目前仍没有最佳的解决方案[9]。

目前国外尚无大规模商业化临床应用的肝脏机械灌注设备，国内也还尚处动物研究阶段，这是国内器官保存研究的机遇与挑战。“时间”一直是器官移植手术中的决定性因素，很多术后并发症发生都与血管吻合时间有关[21]。快速吻合重建一直是外科研究的热点，近年来磁吻合或无缝线血管重建技术在血管外科领域已有不错进展。将磁吻合技术与器官移植进行巧妙结合，也是一个值得研究的方向。这不但缩短了血管、胆道吻合时间，也减少了缝线吻合对于血管内皮的损伤。通过设计一种磁吻合机械灌注设备，将磁环与供受体侧及灌注设备进行串联，可以最大程度实现快速重建[25]。

个体化治疗是临床医学发展的方向。对于肝脏移植而言，肝脏离体前环境条件的不同对于保存期的要求也不同。目前临床肝移植机械灌注争论的焦点也在于灌注参数的设定。不同的灌注方案或许对于不同类型条件下的器官具备保护作用，所以设计一个多环境机械灌注设备是必要的。通过灌注参数及环境的调节设计可以最大程度保护供体。

综上，机械灌注技术应用于临床肝移植可以进一步扩大供体池，一定程度上解决器官短缺问题。但肝脏机械灌注中几个关键问题：灌注温度、灌注时间、灌注压力、液体流速及灌注液选择等尚未被圆满解决，这些也都关系到器官保存效果及手术预后。加快对于机械灌注设备的研究、优化灌注参数，使机械灌注早日大规模临床应用，可以为肝脏移植研究带来新的希望。

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The Application of Machine Perfusion on Clinical Liver Transplantation

【 Writers 】REN Fenggang1,2,3, ZHU Haoyang1,2,3, YAN Xiaopeng1,2,3, LIU Chang1,2,3, ZHANG Xiaogang1,2,3, LV Yi1,2,3
1 Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University, Xi’an, 710061
2 XJTU Research Institute of Advanced Surgical Technology and Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an, 710061
3 Regenerative Medicine and Surgery Engineering Research Center of Shaanxi Province, Xi’an, 710061

【 Abstract 】Liver transplantation is the only way to treat end-stage liver disease. In order to overcome the shortage of donor, marginal donors have been used widely, which bring about a series of problems. Machine perfusion can stimulate the circulation in vivo and is beneficial for the protection of liver. It could also improve the graft function and reduce postoperative complications, which makes it a hot spot in recent years. The aim of this study is to summarize the current status and prospects of application of machine perfusion on clinical liver transplantation.

liver transplantation, organ preservation, machine perfusion

R657.3

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2015.06.011

1671-7104(2015)06-0427-05

2015-08-03

西安交通大学第一附属医院长学制医学生临床创新科研基金(15ZD09)

吕毅，教授，博导，E-mail: luyi169@126.c°m