消化系统恶性肿瘤多中心标本库的建立及管理

【作者】沈思，沈君炜，朱樑，吴超群，李东良，余宏宇，邱媛媛，周薏，姚定康

1 第二军医大学附属长征医院，上海市，200003

2 复旦大学生命科学学院，上海市，200433

3 南京军区福州总医院，福州市，350000

4 上海市中西医结合医院，上海市，200082

消化系统恶性肿瘤多中心标本库的建立及管理

【作者】沈思1，沈君炜1，朱樑1，吴超群2，李东良3，余宏宇1，邱媛媛1，周薏4，姚定康1

1 第二军医大学附属长征医院，上海市，200003

2 复旦大学生命科学学院，上海市，200433

3 南京军区福州总医院，福州市，350000

4 上海市中西医结合医院，上海市，200082

为探讨建立及管理消化道恶性肿瘤多中心标本库的有效策略，该文设计了多中心标本库管理系统并制定标准化操作流程(SOPs)。牵头全国十家医院合作收集标本。建库半年收集消化道恶性肿瘤患者标本共695份。标本临床资料全面完整，统一编号，分类管理。以标本库为基础进行了临床及分子生物学研究，取得了一定成果，为多地区、多种类消化系统恶性肿瘤的研究提供了平台。

消化系统恶性肿瘤；多中心；标本库

0　引言

消化系统恶性肿瘤占全世界恶性肿瘤的50%以上，是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。其中以胃癌、大肠癌、肝癌为最常见。胃癌在全世界癌症相关疾病的病因中排名第三，虽然近年来发病率有所下降，但患者的结局仍令人担忧[2]。我国结直肠癌的年发病率正以4.2%的年增长率飙升，逐渐接近欧美发达国家水平[3]。肝癌在全世界最常见的癌症中排名第五，每年的发病人数与死亡人数几乎相等，是恶性肿瘤导致死亡的主要病因[4]。因此对消化道恶性肿瘤的早期诊断及治疗的研究迫在眉睫。Bryant J等[5]对门诊224名肿瘤患者进行调查发现，84%的患者愿意将肿瘤组织捐赠给生物标本库，其中92%同意将标本冷冻保存以供实验。Caixeir° NJ等[6]对95名卫生从业人员进行调查发现，56%的从业者支持组建肿瘤标本库并自愿参加标本募捐工作，其中85%对标本库在未来癌症诊断及治疗研究中的重要性深表赞同。随着基因芯片技术、蛋白质谱技术、二代测序技术等新技术的发展，越来越多的肿瘤标记物被发现并应用于肿瘤早期诊断。因此构建一个以消化系恶性肿瘤标本为基础的研究平台，建立大数据综合性标本库对临床研究、靶向药物开发、分子生物学研究及统计学分析都有着重大意义。本文将探讨如何建立消化系统恶性肿瘤多中心标本库，并进行信息化管理。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1标本来源

本标本库为多中心标本库，以上海长征医院为主中心，以上海长海医院、上海市中西医结合医院、上海东方医院、上海市闸北区中心医院、上海市普陀区利群医院、南京军区福州总医院、解放军总院第一附属医院、解放军第八十九医院、南昌大学附属新余市人民医院为分中心，各医院同时开展标本的采集和整理工作，并最终汇总至主中心进行保存，以备试验。本标本库中的血标本、尿标本、粪标本取自住院病人及健康体检的正常人，组织标本取自外科手术后病理学诊断明确的癌组织、癌旁组织和同例临近部位的正常组织。

1.1.2主要设备与试剂

主中心与各分中心采用的主要设备型号相同，试剂来源一致：海尔-80℃深低温冰箱（DW-86L626）；液氮储存罐（CBS）；标本运输箱（FYL-BW-11L）；高速台式冷冻型离心机(1730R)；高速离心机（F-33D-110V）；紫外分光光度仪(Therm° Scientific Nan°Dr°p 2000)；光学显微镜(Olympus SZX7—1013)；制冰机（AF100AS)；超净台（SW-CJ-1FDA）；Triz°l试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒等均购自TAKARA公司；DEPC水购自上海威奥生物技术有限公司；氯仿、异丙醇购自南通普艾特化工有限公司。

1.1.3患者知情同意书

留取标本前均经过健康体检志愿者、患者本人或家属同意，并签署知情同意书。在不损害标本提供者利益和隐私的前提下进行标本的收集工作。本标本库的全部标本及标本提供者的临床资料均只用于医学科研，并保证合理合法。

1.2方法

1.2.1标本库专业人员的培训

标本库的管理方式是在统一病例入选标准、标本的收集和处理程序的前提下，主中心总体控制，各分中心各自管理。每个分中心委派具体负责人，管理日常标本收集整理、临床资料登记、数据上传至主中心等具体事务。参与者包括各医院消化科、普外科等本课题组内人员，每个分中心5～10人，均为临床医学本科以上学历，并进行了标本收集及临床资料收集随访等相关业务的培训，在专业技术人员的指导下通过上岗考核后方可纳入[7]。

1.2.2数据库的建立与信息化管理

标本信息化管理采用我课题组自行设计的数据管理软件，以Wind°ws XP为系统运行平台，输入账号、密码可登陆系统，完成数据的导入、导出、查询及简单的统计分析。根据课题组情况，该软件设置了3种登记表：标本信息登记表、标本出库登记表、标本运输登记表。软件具有上传图片功能，可将影像学检查电子图像、辅助检查化验单照片、手术大体标本及病检转移淋巴结的照片通过互联网在软件平台实时发送给主中心。各分中心之间无法共享数据，不同级别的用户只能在自己的使用权限下进行操作。通过对659份标本信息的录入和上传，验证了该软件拥有完善的数据录入、查询界面，这种简单便捷的管理手段可操作性较强，有效提高了标本信息管理的准确性。

标本库标本的留取、处理、存放、出库、入库等由专人负责管理。①标本入库前需填写标本信息登记表，其内容包括：标本提供者性别、年龄、标本来源（手术室、住院部、门诊、体检中心等），如为住院病人需登记住院号、床号；临床诊断；辅助检查结果；标本类型（正常、癌、癌旁、腺瘤、息肉等）；标本性质（原发、复发、转移等）；肿瘤标本分期；分化程度；治疗过程；标本种类（血、尿、粪、组织）；采集时间（标本离体时间）；低温时间（放入深低温冰箱保存时间）；标本编号；位置登记号；流水号；手术医生；采集员；记录员。②标本资源必须用于课题组的相关研究，物尽其用，减少不必要的浪费。使用者应为课题组成员，需严格遵守管理规范，提交申请书，写明需要的标本类别，数量，研究方法等，由管理员和主中心负责人签字同意方可取出，申请书由主中心负责人统一保管，并且在出库登记表中登记对应编号的标本的出库日期，出库数量，使用者。标本出库时尽量减少冰箱打开的时间及次数，防止标本冻融，已出库的标本不得重复入库使用。

1.2.3血标本的留取

住院患者要求尽量3 d内清淡饮食，尽量空腹采血，一般在晨起早餐前采血。抽取全血5 mL，颠倒混匀，为防止溶血，置于5 mL EDTA-K2真空抗凝采血管内保存；血样抽取后尽快送至实验室，若不能及时送出需将其储存于4°C冰箱，且时间绝不能超过2 h[8]。以3 000 r/min转速离心10 min[9]，离心后检查全血分为三层，上层淡黄色液体为血浆，中层为富含血小板的白膜层，下层为红细胞；检查无溶血后，小心吸取上层血浆，避免污染；吸取血浆分装至1.5 mL eppend°rf管内，每管200 mL；每5 mL血液可留取6～8管，并在管盖和管壁标记标本登记号。将分离出的血浆尽快保存[10]。

1.2.4尿标本的留取

保证所有标本提供者在样品采集之前1周未服用抗生素药物，留取晨起清洁中段尿。尿液用一次性带盖尿液试管采集，上有标本登记号，收集尿液量约30～50 mL，对于尿量的收集，原则是越多越好，以便于下一步提取足量的RNA，目前我们采用50 mL离心管取尿液，将装好尿液的离心管放入干燥、清洁的有盖容器内带到医院，注意此过程不需冷藏运输，尽快保存。

1.2.5粪标本的留取

(1) 清肠导泻收集法

医生可在肠镜检查者预约肠镜时发放带盖常规大便标本盒，患者在肠镜检查当天口服泻药后腹泻，嘱患者收集腹泻肠液10～15 mL，放入干燥、清洁、无吸水性的50 mL粪便盒或15 mL离心管带到医院，盒上有标本登记号，尽快保存。

(2) 常规粪便收集法

所有标本提供者在样品采集之前1周未服用抗生素药物，粪便留取前一天尽可能素食，粪便用一次性带盖粪便盒采集，盒上有标本登记号，留取自然排泄粪便，收集粪便量约10g(约拇指头大小)，放入干燥、清洁、无吸水性的50 mL粪便盒内带到医院，尽快保存。

1.2.6组织标本的留取

在肿瘤离体1 h内留取组织[11]，分别取癌组织，癌旁组织（距癌肿边缘2 cm至5 cm范围内），正常组织（距癌肿边缘5 cm以上范围内）[12]。手法如下：用止血钳夹取至肠壁黏膜或黏膜下层（注意：组织不宜夹取过多，不可取到肌层），以手术刀片或剪刀快速切取0.5 mm×0.5 mm（黄豆粒大小）组织块，标本上附着的软组织如脂肪等，如属非病变成分，则应尽量剥去或切除，以利正确留取组织。将组织块分别放于相对应的冻存管中，标本最好悬浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部，都不利于固定液对标本的渗入。留取的过程中需注意，任何固定液对人体都有损害作用，因此固定液的容器必须密闭，以防挥发损伤器官和眼睛，忌用手与固定剂直接接触，以免损伤皮肤。众多研究发现为减少热缺血时间，组织标本从离体到冻存不得超过30 min[12-15]。将有标本登记号的冻存管按照存放标准放置保存。

1.2.7标本的运输

多中心标本的运输分为同城标本运输和异地标本运输。同城标本由专人用装有冰块或冰袋的标本运输箱在规定时间内将其送至实验室，填写标本入库登记表，技术人员将标本处理后保存于-80°C冰箱。异地标本采用冷链运输方式，负责人联系冷链物流公司，确认标本运输储存温度，目前国内冷机制冷可达最低温度为-22°C。计划每批次标本的数量，选择合适的包装耗材。各异地分中心在启动前，出具相关证明文件给物流公司，在各地机场提前备案。物流公司提供整个项目的运输计划书，课题组开会通过后签订相关运输合同。标本在分中心收集好后，由专人负责邮寄并填写标本运输登记表，写明标本数量、运输时间、包装方式、快递单号，以便主中心负责人跟踪邮件，监督运输造成的标本质量问题并记录反馈[16]。

2　结果

2.1建立规范化的标本收集流程

建立标本库前期，课题组成员开会研究，制定了标准化操作流程SOPs（Standard Operati°n Pr°cedures），包括标本收集、处理、运输、保存和信息反馈等相关技术的建立，如图1。经过主中心及两个分中心两周内近30例标本的试运行验证，确定了该方案的可行性，并修改完善了各项技术，强调了收集标本中易犯错误及需注意的细节，使标本收集工作更加标准化、规范化。

图1　规范化标本库建设流程图Fig.1 Fl°w chart °f standardized specimen library c°nstructi°n

2.2标本收集情况

本标本库自2015年3月开始收集标本的工作，建库半年收集了消化道恶性肿瘤患者的标本695份，其中组织标本199份，血浆标本259份，尿液标本132份，粪便标本105份。同一患者收取的标本种类根据临床工作的具体情况而定，而非四种标本全部收取。标本提供者中胃癌患者125例，肝癌患者6例，健康体检志愿者37例，大肠癌患者150例，其中早癌组5例，晚癌组145例，由于部分大肠息肉有恶变倾向，甚至与早癌界限不清，我们还收集了79例大肠息肉患者的标本。

2.3标本质量监控

在收集标本的过程中，不断总结经验，每半年完成阶段性记录，对所取标本的质量进行检验和记录，并根据检验结果对标本留取、运输、处理和储存的方法及条件给予合理调整。2015年9月末，课题组随机抽取6份标本，进行总RNA鉴定，紫外分光光度计读取OD260/OD280的比值均在1.8～2.0之间，说明所得RNA浓度较高。1%琼脂糖凝胶电泳结果如图2，第1列为RNA marker，2～7列为标本RNA，第8列为空白对照，每个标本均有三个RNA 条带，从上到下分别是28S，18S以及5S。表明RNA保存比较完整，能够满足后续试验要求[17]。

图2　6例总RNA标本的琼脂糖凝胶电泳Fig.2 Agar°se gel electr°ph°resis °f 6 cases °f t°tal RNA was analyzed

2.4本标本库的优势及创新点

根据收集的标本数据，经统计分析得到如下结果：胃癌患者中男性患者77例，约占61.6%，女性患者48例，约占38.4%，男性明显高于女性。大肠癌及大肠息肉患者中对比各组患者性别统计数据发现，三组患者女性人数均略高于男性，如图3。胃癌患者年龄分布如图4，可见胃癌患者年龄在51岁～60岁区间人数最多，大肠癌患者年龄分布如图5，可见大肠癌患者年龄在61～70岁区间人数最多。以上结果均具有统计学意义。

本标本库的优势为：①标本库为多中心标本库，可以在短时间内或试验进行的同时迅速收集大量标本，提高了研究的效率，达到事半功倍的效果。而且标本来源广，避免了在同一家医院或同一地区的医院收集标本所造成的局限性，使研究结果具有更广泛的意义，可信度较大；②标本取自全国不同的省市，具有地域性的特点，可单独研究某一地区的肿瘤患者的发病、诊治及预后的情况；③全部标本除记录标本位置登记号，流水号外，还对应登记国际疾病分类标准编码[ICD-10]，与国际接轨，便于同国外标本库进行合作研究[18]；④本标本库正在逐渐开展家族遗传病例的收集，目前已收集家族遗传性结肠息肉的组织及血液标本，共8例，标本全部为来自同一家族的患者，且均为直系亲属。

图3　大肠癌及息肉患者性别分布Fig.3 Sex distributi°n in patients with c°l°n cancer and p°lyps

图4　胃癌患者年龄分布Fig.4 Age distributi°n °f gastric cancer patients

图5　大肠癌患者年龄分布Fig.5 Age distributi°n °f c°l°n cancer patients

3　讨论

近年来，随着基因芯片技术、蛋白质谱技术、二代测序技术等新技术的发展，临床试验和分子生物学试验都进入了大数据时代，研究对象从动物和细胞株逐渐转向人体本身，对恶性肿瘤的研究也逐渐从临床研究进展到对肿瘤相关基因和蛋白质结构及功能的探索，因此国际上正规的恶性肿瘤的标本库相继涌现，美国组织库协会AATB(American Ass°ciati°n °f Tissue Banks)于1984年制定了第一部组织标本库的权威性标准[19]；1987年，美国国立卫生院建立人类组织协作网CHTN(C°°perative Human Tissue Netw°rk)，收集组织标本20万份以上[20]；1993年，美国MD Anders°n癌症中心建立世界上最早的专业肿瘤标本库[21,22]；同年欧洲组织库协会EATB(Eur°pean Ass°ciati°n °f Tissue Banks)成立，并制定EATB标准[23]；2003年，英国建立国家肿瘤组织库[24]；同年，欧洲癌症机构组织OECI(Organizati°n °f Eur°pean Cancer Institutes)建立欧洲人类冰冻肿瘤组织标本库Tubafr°st(Eur°pean Human Tum°r Fr°zen Tissue Bank)[25]。近年来，我国多家医疗机构也建立了肿瘤标本库，其中河南肿瘤医院与天津医科大学肿瘤医院分别与挪威和美国合作，使我国肿瘤标本库的建设逐渐标准化、国际化。

我课题组吸收学习了国内外先进的建库及管理技术并根据课题组实际情况设计了信息化自主管理系统，与全国十家医院合作构建消化系统恶性肿瘤标本库，合作对象中，八家为三甲医院，技术力量雄厚，医疗服务覆盖中国东部及北部大部分地区，有能力提供数量多、质量高的标本，是标本库顺利开展的有力保障。标本库自建库以来收集标本共695份，临床资料完整。留取标本前均经过健康体检志愿者、患者本人或家属同意，并签署知情同意书。标本的留取、运输、处理、保存都由专人负责，所有人员均经过专业技术培训并通过任职上岗考核，责任明确，便于管理。课题组核心成员开会讨论制定标准化操作流程SOPs，并分发各分中心负责人。标本出库、入库以及登记表的填写由负责人监督完成。各分中心均配备-80℃深低温冰箱，收取的标本暂时存放于此，完成一阶段收集工作后由专人统一经过冷链运输邮寄至上海长征医院主中心。同时将患者和健康体检者的临床信息通过数据管理软件传送给主中心负责人。每半年随机抽取5～10例标本进行提取RNA鉴定标本质量，并结合标本应用于科研实验的情况进行分析，发现影响标本质量的原因，不断反馈，修正标本收取流程中各环节的问题[26]。

目前，标本库的建立和管理虽然处在初级阶段，但运行顺利，各项程序基本步入正轨，所收标本已应用于课题组的科研工作，并取得了一定成果。下一步工作重点是扩大标本库，今年9月开始开展肝癌标本的收集工作，并将食管癌、胆囊癌、胰腺癌等列入标本库收集对象。我课题组将不断努力，充分保护，合理利用标本，将临床与基础相结合，实现信息和资源共享，为科研提供平台，早日攻克消化系统恶性肿瘤这一难题。

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Establishment and Management of Multicentral Collection Biosample Banks of Malignant Tumors from Digestive System

【 Writers 】SHEN Si1, SHEN Junwei1, ZHU Liang1, WU Chaoqun2, LI Dongliang3, YU Hongyu1, QIU Yuanyuan4, ZHOU Yi1,
YAO Dingkang1
1 Chang Zheng Hospital Affiliated to the Second Military Medical University, Shanghai, 200003
2 School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai, 200433
3 Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou, 350000
4 Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine of Shanghai, Shanghai, 200082

【 Abstract 】To establish and manage of multicentral collection bio-sample banks of malignant tumors from digestive system, the paper designed a multicentral management system, established the standard operation procedures (SOPs) and leaded ten hospitals nationwide to collect tumor samples. The biobank has been established for half a year, and has collected 695 samples from patients with digestive system malignant tumor. The clinical data is full and complete, labeled in a unified way and classified to be managed. The clinical and molecular biology researches were based on the biobank, and obtained achievements. The biobank provides a research platform for malignant tumor of digestive system from different regions and of different types.

the digestive system malignant tumor, multicenter, biobank

R735

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2015.06.006

1671-7104(2015)06-0410-05

2015-10-08

上海市科委科技支撑项目（12142200900）；国家自然科学基金资助项目（11472300）

沈思，E-mail: 896821168@qq.c°m

朱樑，教授，主任医师，E-mail: zhuliangcz@126.c°m