叠层自组装技术在根面构建缓释系统的研究

张弘岑 莲汪俊

·论著·

叠层自组装技术在根面构建缓释系统的研究

张弘岑 莲汪俊

目的使用叠层自组装技术在牙根面构建外源性蛋白缓释系统。方法收集离体下颌第二前磨牙18颗，随机分为6组，a-e组为实验组，进行酸蚀处理；f组为对照组，不作酸蚀处理。各组在不同条件下进行叠层自组装实验，于第1～9天收集样本液，检测吸光度并计算蛋白释放浓度。结果各组样本蛋白均有持续性释放，各组内均呈现缓慢释放的趋势（P＜0.05）。酸蚀处理组蛋白释放量显著高于对照（P＜0.05）；随着原料中蛋白浓度增加，其释放量及缓释速率提高（P＜0.05）；随吸附次数的增加，蛋白释放量也提高（P＜0.05），缓释速率基本不变，但释放维持时间延长。结论叠层自组装技术能有效地在根面构建外源性蛋白的缓释系统。

叠层自组装技术根面处理缓释系统蛋白吸附

牙根表面覆盖有足够的活性牙周膜细胞是牙再植成功的关键[1]。研究证实，根面牙周膜细胞移植可明显改善全脱位牙再植的预后[2-4]。但细胞移植存在诸多缺点，不利于其临床转化。随着组织工程和再生医学的发展，通过诱导内源性干细胞归巢促进组织再生修复已成为一种新的治疗理念，并在多个医学领域得到了证实[5-7]。我们的前期研究发现，通过浸泡法，在延时再植的比格犬前磨牙根面加载外源性趋化因子能够出现一定程度的牙周再生，但再生的成功率并不高[8]。究其原因，可能是由于牙根面很光滑，不利于外源因子的吸附，无法作为趋化因子缓释载体。为此，本实验拟应用叠层自组装技术（Layerby-Layer self-assembly technique，LbL）在牙根面构建外源性蛋白质的缓释系统。

1 材料和方法

1.1 实验试剂和仪器

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、柠檬酸（生工生物工程股份有限公司），明胶（Sigma，美国），藻酸钠（Sigma，美国）。紫外-可见吸收光谱仪（BWTEK，美国）。

1.2 绘制标准曲线

配制浓度为0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1和1.0mg·mL-1的BSA溶液，紫外-可见吸收光谱仪检测，并记录280 nm吸光度，绘制标准曲线。

1.3 制备根片

收集牙根大小、形态相似的离体健康下颌第二前磨牙18颗，随机分为a～f共6个组，每组3颗。去净牙周膜并截冠，流动树脂封闭根管口及根尖孔，透明指甲油封闭截面。

1.4 配制试剂

室温下配制30%的新鲜柠檬酸。40℃环境下配制0.1%的明胶溶液，冷却至室温。室温下配制0.1%藻酸钠溶液，加入BSA，分别配成浓度为0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和1.5 mg·mL-1的藻酸钠-BSA溶液。

1.5 LbL吸附实验

a～e组为实验组，牙根置于30%柠檬酸中，超声环境下浸泡30 min；f组为对照组，牙根置于生理盐水中，超声环境下浸泡30 min。取出牙根，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2次。

各组牙根分别浸泡于10 m L 0.1%明胶溶液中，匀速震荡10 min，PBS冲洗2次，再浸泡于10 m L不同浓度的藻酸钠-BSA溶液中，静置10 min，PBS冲洗2次。将此步骤记为1次LbL吸附（表1）。

表1 样本分组及处理方式Table.1 G rouping and treatment of the specim ens

1.6 检测BSA释放量

将上述各组牙根分别置于10 m L生理盐水中，室温静置。分别于1～9 d时收集各组样本液5 mL，即刻检测280 nm吸光度，重复测量3次。计算累积浓度，绘制曲线图。

1.7 统计学分析

采用SAS 9.2统计软件进行统计分析，组内各时间点累积浓度的差异和组间处理因素的差异（根面酸蚀处理、原料BSA浓度、吸附次数以及是否包覆明胶薄膜）使用重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BSA吸光度标准曲线

对各浓度生理盐水-BSA溶液进行紫外-可见吸收光谱仪检测，并记录280 nm吸光度，绘制标准曲线（图1）。

图1 280 nm处生理盐水-BSA的吸光度标准曲线Fig.1 The standard curve of absorbance of saline-BSA at 280 nm

2.2 BSA释放量

测定各组各时间点对应的样本液累积浓度，结果显示各组样本在实验时间内均有持续性释放，其中a、b、c三条曲线在6～7 d后逐渐趋于平缓，而d、e、f三条曲线到9 d时仍能保持相对恒定的释放速率（图2）。

图2 各组样本随时间的BSA释放浓度均值曲线Fig.2 The average curve of BSA release concentration in each sam ple

本实验各组样本均呈现缓慢释放的趋势（P＜0.05），表明叠层自组装技术能够有效地在牙根表面构建外源性蛋白缓释系统，吸附BSA并持续性释放。

BSA释放浓度均值曲线显示，曲线d明显高于曲线f，趋势分析与组间差异均具有显著差异（P＜0.05），表明未经处理的牙根表面使用LbL技术也能够吸附上BSA，但酸蚀处理能够显著提高其释放量。

a、b、c三条曲线走势相似，趋势分析与组间差异均具有统计学意义（P＜0.05），表明当吸附次数一定（均为2次）时，LbL所用原料中BSA的浓度能够影响其释放量，在一定范围内随浓度增加，释放量及缓释速率也提高。

曲线b在6～7 d后趋于平缓，而曲线d在9 d时仍然保持较为恒定的释放速率，趋势分析与组间差异均具有统计学意义（P＜0.05），表明原料中BSA浓度一定时，随LbL吸附次数的增加其释放量也提高，缓释速率基本不变，但释放时间延长。

d、e两条曲线基本重叠，趋势分析差异具有统计学意义（P＜0.05），但组间差异无显著性（P＞0.05），表明在最外层包覆明胶薄膜能够影响各时间点的BSA释放量，但不足以对整体释放水平造成显著性改变。

3 讨论

本实验首次将叠层自组装技术应用于延时再植牙的研究。该技术是一种生理多功能性纳米薄膜制造技术[9]，在众多自组装方法之中，分子沉积自组装的应用最为广泛，其原理是使带有相反电荷的材料（聚阳离子和聚阴离子）交替沉积[10]，常在生物及生物材料领域用于携带药物以达到缓释作用。

研究证实，使用酸蚀剂对牙根面进行酸蚀处理能暴露胶原纤维，使根面呈微孔结构[11-12]，这种微观形貌可提高牙周细胞对根面的黏附和增殖能力[13]，还可提供天然的支架结构，利于外源性因子的缓释。此外，酸蚀处理能改善根面的生物相容性，促进外源性因子的吸附[11-12]。常见的根面酸蚀处理剂有30%柠檬酸、24%乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）和37%磷酸[14]。其中，30%柠檬酸因其有效的去污能力得到广泛应用[15]。我们的前期实验证实，以30%柠檬酸在超声环境下浸泡30 min能够简便有效地暴露根面胶原纤维网，故本实验中均采用这一方法。其作用机制可能是经酸蚀处理的根面胶原纤维暴露，一方面增加了牙根表面面积，另一方面纤维网中密集的孔隙提供了聚电解质吸附的通道，进而提高了整个牙根对蛋白质的吸附能力。

本实验使用LbL技术在根面加载外源性蛋白质并检测其持续释放效果。结果表明，LbL技术能够简便有效地在牙根表面构建外源性蛋白的缓释系统，吸附BSA并达到缓释作用，根面酸蚀处理能够提高蛋白的释放量，不同的组装条件也会影响蛋白释放情况。由于细胞因子是蛋白质类物质，故本实验提供了一种在根面加载细胞因子的新型方法，但其在延时再植中的具体临床意义还需细胞因子吸附实验及体内实验进一步证实。

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Layer-by-layer Self-assembly Coating in the Construction of Sustained Release System on Root Surface

ZHANG Hong1,CEN Lian2,WANG Jun1.
1 Department of Pediatric Dentistry,Shanghai Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 School of Chemical Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China.Corresponding author:WANG Jun(E-mail:wangjun202@hotmail.com).

Objective To construct a sustained release system of exogenous protein on the root surface using layer-by layer self-assembly coating technique.M ethods Eighteen healthy mandibular second premolars were collected and randomly divided into 6 groups,group a-e were experimental groups with acid etching,group f was a control group without etching.Each group went through layer-by-layer adsorption experiments under different conditions.Samp les were collected and detected absorbance on day 1-9 in each group to calculate the concentration of protein release.Results All sets of samples showed sustained-release trend(P＜0.05).Etching group showed a significant increase of protein release compared with control group(P＜0.05);Release rate and amount increased with the protein concentration in the materials(P＜0.05); More adsorption times leaded to larger release amount and prolonged time(P＜0.05).Conclusion Sustained release system of exogenous protein can be constructed on the root surface using layer-by layer self-assembly coating technique.

Layer-by-Layer;Root surface conditioning;Sustained release system;Protein absorption

Q813.1+2

A

1673－0364（2015）03－0121－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.03.001

2015年4月3日；

2015年5月11日）

上海市科委医学引导项目（124119b0101）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院儿童口腔科（张弘，汪俊）；200237上海市华东理工大学化工学院（岑莲）。

汪俊（E-mail:wangjun202@hotmail.com）。