TRIM28对肺鳞癌SK-MES-1细胞生长的影响*

马春虎，许 倩，沈荣飞，肖铄洋，李冰清，任 祎（.承德医学院，河北承德 067000；.承德医学院基础医学院0级临本0班）

TRIM28对肺鳞癌SK-MES-1细胞生长的影响*

马春虎1，许 倩1，沈荣飞2，肖铄洋2，李冰清2，任 祎2
（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院基础医学院2012级临本10班）

目的：探讨TRIM28基因对肺鳞癌细胞系SK-MES-1细胞生长的影响。方法：采用RNA干扰技术抑制肺鳞癌SK-MES-1细胞TRIM28基因的表达，通过RT-PCR和Western-blot技术检测抑制效果，应用克隆形成实验和MTT实验观察TRIM28基因被抑制后SK-MES-1细胞的增殖和活性。结果：RNA干扰技术能有效抑制TRIM28基因在肺鳞癌SK-MES-1细胞中的表达。TRIM28基因被抑制后，肺鳞癌SK-MES-1细胞的活性和生长受了到明显抑制。结论：TRIM28对肺鳞癌SK-MES-1细胞的生长具有促进作用。

肺鳞癌；TRIM28；RNA干扰

肺癌是全世界范围内发病率最高的恶性肿瘤，其中80%以上为非小细胞肺癌，鳞状细胞癌是其中最主要的类型［1］。肺癌5年存活率仅为15%，大部分患者确诊时已到晚期［2］。因此，寻找新的治疗靶点迫在眉睫。最新研究发现，TRIM28是肿瘤发生中关键的调节因子［3］。作为一种核共抑制因子，TRIM28与细胞DNA损伤后染色质介导的转录抑制和DNA修复有关。TRIM28能通过抑制p53的活性从而增强细胞对DNA损伤的敏感性并抑制细胞凋亡；另外，当TRIM28异常表达时，可抑制E2F1的转录及促凋亡功能。但有关TRIM28基因在肺癌中生物学作用的报道较少。本研究采用RNA干扰技术观察了TRIM28基因对肺鳞癌SK-MES-1细胞生长的影响，初步探讨TRIM28在非小细胞肺癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺鳞癌细胞系SK-MES-1为承德医学院基础医学研究所保存。DMEM培养基、胎牛血清，美国GIBICO公司；转染试剂Lipofectamine 2000，美国Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Taq酶，日本TaKaRa公司；兔抗人TRIM28多克隆抗体，美国Proteintech公司。

1.2 细胞培养 SK-MES-1细胞采用DMEM培养基（含10%胎牛血清）于CO2培养箱（37℃、5% CO2）静置培养。当细胞生长状态良好并且融合度达到80%左右时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化进行细胞传代。

1.3 siRNA转染SK-MES-1细胞 TRIM28-siRNA：5'-GATGA TCCCTACTCAAGTGTT-3'，对照siRNA（scrambled）：5'-GTTC TCCGAACGTGTCACGT-3’（上海吉玛生物试剂公司）。

SK-MES-1细胞至对数生长期后以2×105/孔接种于96孔培养板，随机分为实验组和对照组，采用Lipofectamine 2000脂质体分别转染TRIM28-siRNA和对照siRNA，终浓度为40nM，每组设3个复孔。转染6h后更换成DMEM培养液，继续常规培养。

1.4 转染后SK-MES-1细胞TRIM28 mRNA和蛋白表达的检测 转染48h时收集细胞，分别检测SK-MES-1细胞TRIM28 mRNA和蛋白的表达。

1.4.1 RT-PCR法检测TRIM28 mRNA：提取SK-MES-1细胞的总RNA，并逆转录为cDNA。PCR反应体系为：2.5μl cDNA模板，20μmol/L引物（TRIM28上游引物：5'-ATGTGAGCGTGTACTGCTGG-3’、下游引物：5'-ACGTCTGCCTTGTCCTCAGT-3'），0.2mM dNTP，50mM Tris-HCl（pH 8.3），10mM KCl，5mM （NH4）2SO4，2mM MgCl2，0.75U Taq酶，总体积为25μl。反应条件：95℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸7min。

1.4.2 Western-blot法检测TRIM28蛋白：收集SK-MES-1细胞蛋白，常规BCA方法进行定量。制备15%聚丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE电泳（2-3h），转移到PVDF膜（50min），室温5% BSA封闭1h，稀释兔抗人TRIM28多克隆抗体（稀释度1：1000）4℃孵育过夜，ECL发光液显色曝光。

1.5 平板克隆形成实验 TRIM28-siRNA转染细胞24h后，胰酶消化细胞，以200个/孔接种于6孔板，加DMEM培养基（含10%胎牛血清）2ml/孔继续培养10d，常规固定染色，显微镜下计数集落，以≥50个细胞作为一个集落，并计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.6 MTT法 胰酶消化对数生长期细胞，以1×104/孔接种于96孔板，培养24h后转染TRIM28-siRNA，终体积为100μl/孔，每组设4个复孔；6h后每孔加入含20%小牛血清、无抗生素的DMEM细胞培养液，100μl/孔，孵育48h后，弃去培养液，加入MTT溶液（20μl/孔）培养4h，吸出孔内培养液后加入DMSO液（150μl/孔），采用酶标仪于550nm处检测吸光度值。

1.7 统计分析 采用SPSS 16.0软件进行统计处理，两组间计量资料的比较行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA干扰后SK-MES-1细胞TRIM28 mRNA和蛋白的表达 与对照siRNA［mRNA（0.91±0.09）、蛋白（0.90± 0.06）］比较，TRIM28-siRNA能明显抑制肺鳞癌SKMES-1细胞TRIM28 mRNA（0.19±0.08）和蛋白（0.28± 0.09）的表达水平（P＜0.05）。见图1-2。

图1 肺鳞癌SK-MES-1细胞TRIM28 mRNA的表达（1.对照siRNA，2.TRIM28 siRNA）

2.2 siRNA干扰后SK-MES-1细胞克隆形成数 TRIM28-siRNA组细胞克隆形成数显著低于对照组克隆形成数，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，附表、图3）。说明TRIM28 siRNA干扰可明显抑制SK-MES-1细胞增殖。

图2 肺鳞癌SK-MES-1细胞TRIM28蛋白的表达（1.对照siRNA，2.TRIM28-siRNA）

图3 肺鳞癌SK-MES-1细胞克隆形成数（1.对照siRNA，2.TRIM28-siRNA）

2.3 siRNA干扰后SK-MES-1细胞的活性 转染48h，实验组SK-MES-1细胞的活性明显低于对照组（P＜0.05）。见附表：

附表 TRIM28 siRNA干扰对SK-MES-1细胞增殖和活性的影响（±s，n=4）

附表 TRIM28 siRNA干扰对SK-MES-1细胞增殖和活性的影响（±s，n=4）

组别 SK-MES-1细胞克隆形成数 SK-MES-1细胞活性实验组 299±12 0.88±0.22对照组 725±24 2.29±0.08 P ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

TRIM蛋白是RING型E3泛素配体亚家族成员，在人类和小鼠中有70多种，广泛参与各种生物进程，包括转录调节、细胞生长、凋亡、发育和肿瘤形成等。多种TRIM蛋白能够参与核受体的调节过程，如TRIM19定位于细胞核PML核体中，调节多种反应过程，如细胞应激、DNA修复和病毒感染等［4］；TRIM24调节维甲酸受体α、甲状腺受体等核受体，并能增强维甲酸受体α介导的转录［5］；TRIM13过表达能引起p53表达增强，进而促进凋亡；TRIM29通过与TIP60相互作用调节p53蛋白，过表达预示胃癌的临床预后较差［6］。另有研究发现，其它的TRIM蛋白，如TRIM32、TRIM8和TRIM40，与特异性肿瘤的发生有关。

TRIM28（又名KAP1），由Friedman在1996年最早鉴定，是核磷脂酰肌醇-3激酶（PIKK）家族的新成员，是必需的表观遗传稳定基因［7］。TRIM28在DNA损伤后迅速被PIKK其它家族成员磷酸化，磷酸化的TRIM28快速定位于核内DNA链上，说明其与细胞DNA损伤后染色质介导的转录抑制和DNA修复具有重要的关联。已经证实，TRIM28可通过α螺旋区与MDM2的中心酸性结构域结合并协同作用，使p53去乙酰化和抑制P53活性［8］。研究中可通过RNA干扰抑制非小细胞肺癌内源性TRIM28的表达，进而增强p53的转录活性，从而促进细胞凋亡。另外，Chen等发现［9］，TRIM28能够促进E2F1-HDAC1复合物的形成并抑制E2F1乙酰化，当异常表达TRIM28时，具有抑制E2F1的转录及促凋亡功能。以上研究均提示，TRIM28可能在肿瘤的发生发展中发挥作用。

本研究设计了针对TRIM28基因的siRNA序列，并转染到肺鳞癌细胞系SK-MES-1细胞中，证实该siRNA能够较好地抑制TRIM28的表达。同时研究发现，有效抑制肺鳞癌SK-MES-1细胞的TRIM28基因后，SK-MES-1细胞的增殖和活性受到了明显抑制。因此提示，作为通用的核抑制物，TRIM28对非小细胞肺癌细胞生长具有明显促进作用，可能在非小细胞肺癌进展中发挥重要作用。但关于TRIM28基因促进非小细胞肺癌生长的作用机制还有待深入研究。

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［3］Hatakeyama S. TRIM proteins and cancer［J］. Nat Rev Cancer，2011， 11（11）： 792-804.

［4］El Bougrini J， Dianoux L， Chelbi-Alix MK. PML positively regulates interferon gamma signaling［J］. Biochimie， 2011， 93（3）：389-398.

［5］Tisserand J， Khetchoumian K， Thibault C， et al. Tripartite motif 24 （Trim24/Tif1α） tumor suppressor protein is a novel negative regulator of interferon （IFN）/signal transducers and activators of transcription （STAT） signaling pathway acting through retinoic acid receptor α （Rarα） inhibition［J］. J Biol Chem， 2011， 286（38）：33369-33379.

［6］Yuan Z， Villagra A， Peng L， et al. The ATDC （TRIM29） protein binds p53 and antagonizes p53-mediated functions［J］. Mol CellBiol， 2010， 30（12）： 3004-3015.

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［9］Chen L， Chen DT， Kurtyka C， et al. Tripartite motif containing 28 （Trim28） can regulate cell proliferation by bridging HDAC1/E2F interactions［J］. J Biol Chem， 2012， 287（48）： 40106-40118.

INFLUENCES OF TRIM28 ON GROWTH OF LUNG SQUAMOUS CELL CARCINOMA SK-MES-1 CELLS

MA Chunhu， XU Qian， SHEN Rong-fei， et al

(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective：To study the influences of TRIM28 gene on growth of lung squamous cell carcinoma SKMES-1 cells.Methods：TRIM28 gene was inhibited by RNA interference assay， RT-PCR and Western-blot was used to detect the inhibitory effects. After the TRIM28 gene was inhibited， the proliferation and activity of SK-MES-1 cells were detected respectively by clone formation assay and MTT cell proliferation assay.Results：Expression of TRIM28 in SK-MES-1 cells was inhibited significantly by RNA interference. The activity and growth of SK-MES-1 cells decreased obviously after the TRIM28 gene was inhibited.Conclusions：TRIM28 can promote the growth of lung squamous cell carcinoma SK-MES-1 cells.

Lung squamous cell carcinoma； TRIM28； RNA interference

R734.2

A

1004-6879（2015）01-0005-04

2014-06-03）

* 河北省自然科学基金项目（C2010001353），河北省教育厅资助项目（QN20131010）