菌株YGL-B-0转化甘草酸过程中甘草次酸含量的测定*

周艳艳，张 琳，刘 沛，刘翠哲

（河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

菌株YGL-B-0转化甘草酸过程中甘草次酸含量的测定*

周艳艳，张 琳，刘 沛，刘翠哲△

（河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

目的：高效液相色谱法测定菌株YGL-B-0转化甘草酸过程中甘草次酸的含量。方法：采用ZORBAX SB-C18色谱柱（2.1×150mm，3.5μm），预柱ZORBAX SB-CB（2.1×12.5mm，5μm），柱温28℃，流动相为甲醇：乙腈：0.5%甲酸水=20：40：40（V/V），流速为0.2ml/min，检测波长250nm。结果：甘草次酸在0.1-1.6μ g范围内线性关系良好（r=1.0000），甘草次酸的平均回收率为99.6 %-101.9%，RSD分别为1.21%、2.13%和1.70%（n=3）。菌株YGL-B-0发酵培养72h甘草次酸的含量为11.70mg/ml。结论：本研究建立的方法简便可行，重复性好、专属性强，可用于测定菌株YGL-B-0转化甘草酸过程中甘草次酸的含量。

菌株YGL-B-0；含量测定；甘草次酸；最佳发酵条件

甘草次酸在体内外的活性均强于甘草酸，在食品、美容和医药等方面具有多种药理作用［1-2］。目前，甘草次酸生产工艺多为酸水解法，效率不高且污染环境，因此急需探寻一种高效环保的甘草次酸生产工艺。本实验室筛选获得酵母菌菌株YGL-B-0，该菌株可将甘草酸转化为甘草次酸。酵母菌具有兼性厌氧特性、发酵过程中毒副产品少、易培养和传代时间短等优势，被广泛应用于食品工业的生产中，比目前发现的可将甘草酸转化为甘草次酸的霉菌更加经济安全。本研究拟建立酵母菌菌株YGL-B-0转化甘草酸过程中甘草次酸含量测定的方法，为后期菌株YGL-B-0最佳发酵条件的优化奠定基础，旨在使其有更高的转化效率，达到高效性、环保性等特点，能更适合于工业化生产。

1 实验材料与药品

菌株YGL-B-0（承德医学院中药研究所药剂室分离纯化）；甘草酸粗品（甘草酸浓度为60%，南通飞宇生物科技有限公司）；甘草酸对照品，甘草次酸对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：100551-200501、110723-200612）；甲醇，乙腈，甲酸（色谱级）；链霉素，虎红钠盐，蔗糖（分析纯）；马铃薯。

种子液培养基［3-4］：200ml蒸馏水中加入40.00g去皮切块的马铃薯，煮沸30min左右，4-6层纱布过滤，滤液中加入4.00g蔗糖，加蒸馏水定容至200ml。121℃灭菌30min，温度降至50℃左右时加入10.0mg链霉素以抑制细菌的生长和繁殖，用以培养真菌。

发酵培养基：同种子液培养基，另加入甘草酸粗品1.40g。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱ZORBAX SB-C18（2.1×150mm，

3.5μm），预柱ZORBAX SB-CB（2.1×12.5mm，5μm）；柱温28℃；流动相甲醇：乙腈：0.5%甲酸水（20：40：40）；流速0.2ml/min；检测波长250nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备：精密称取甘草次酸对照品2.50mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.1mg/ml对照品溶液，4℃冰箱保存备用。

2.2.2 供试品溶液的制备：种子液的制备：将YGL-B-0菌株从4℃冰箱取出，室温放置0.5h左右，无菌条件下接种于装有种子液培养基的50ml锥形瓶中（装样量为40%），置于30℃恒温振荡器中培养，转速为120r/ min，监测菌液OD505nm。当OD505nm为0.38-0.42时，即得种子液。

实验组：取种子液200 μ l，接种于装有发酵培养基的50ml锥形瓶中（装样量为40%），于30℃恒温振荡器中发酵培养，转速为120r/min。72h后取样200μl，加入1200 μl甲醇，超声破壁5min后［5-6］，15000r/min离心15min，取上清液700 μl，50℃水浴下用N2吹干，加入700μl的纯净水，涡旋2min后加入700μl的乙酸乙酯，涡旋2min后静置2h，再次涡旋2min、静置12h，取离心管中上层的乙酸乙酯相350μl，50℃水浴下用N2吹干，加入700μl甲醇超声复溶1min，15000r/min离心15min，取上清液即为供试品溶液。

空白对照组：吸取200μl种子液培养基（无YGL-B-0菌株），接种于装有发酵培养基的50ml锥形瓶中（装样量为40%），处理方法同实验组，即得空白对照组样品。

阴性对照组：取种子液200μl，接种于装有种子液培养基的50ml锥形瓶中（装样量为40%，无甘草酸粗品），处理方法同实验组，即得阴性对照组样品。

2.3 线性关系考察 取适量2.2.1制备的对照品溶液，按2.1的色谱条件进样，依次进样1、2、4、8、16μl。以甘草次酸色谱峰面积对浓度做标准曲线，回归方程为Y=2.0E+7X+24763，r=1.0000。结果表明，甘草次酸在0.1-1.6μg范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验 取2.2.1制备的对照品溶液，连续进样6次，进样量5μl，测得甘草次酸的峰面积RSD为2.12%，结果表明仪器具有良好的精密度。

2.5 重现性试验 取5份实验组供试品溶液，按2.1色谱条件进样后，计算含量，测定甘草次酸的RSD为2.86%，表明重现性良好。

2.6 稳定性试验 取实验组供试品溶液，分别于0、4、8、16、32、72h按2.1的色谱条件进样测定，6个时间点甘草次酸峰面积的RSD为2.46%，表明供试品溶液在4℃冷藏条件下，72h内稳定性良好。

2.7 专属性考察 取阴性对照组供试品溶液，按2.1的色谱条件进样5μl，未出现甘草次酸峰，说明该方法专属性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的同一实验组供试品溶液，加入一定量甘草次酸对照品溶液，测定并计算回收率，结果见附表：

附表 加样回收率试验结果（n=3）

2.9 样品测定 分别取实验组供试品溶液、空白对照组供试品溶液各5份，5 μl进样测定，计算得甘草次酸的平均含量为11.70mg/ml，RSD为2.32%。

3 讨论

经紫外全波长扫描，确定甘草次酸的检测波长为250nm；本研究选择的流动相为甲醇：乙腈：0.5%甲酸水=20：40：40（V/V），在此条件下甘草次酸峰型对称，应用的甲酸能够改善拖尾现象且减少对色谱柱的损害。甘草酸粗品灭菌后含量降低9.2%，因降低量在可允许的范围内，因此，甘草酸粗品可以直接加入培养基进行高压蒸汽灭菌。

本研究建立的高效液相色谱测定方法测得菌株YGL-B-0发酵培养72h后甘草次酸的含量为11.70mg/ ml，该方法简便可行，重复性好，专属性较强，切实可行，可用于后期确定菌株YGL-B-0转化甘草酸为甘草次酸的最佳发酵条件，旨在使其有更高的转化效率，达到高效性、环保性等特点，并使其适合于工业化生产。

［1］宋丽，徐璐扬，张宁.大鼠肠内微生物对甘草酸代谢的影响［J］.上海中医药杂志，2006，42（9）：70-72.

［2］李娜，韩超.浅谈微生物发酵制药［J］.中国科技博览，2012，（24）：426.

［3］杨勇，张凤英，陈岑.PDA培养基改良配方的研究［J］.酿酒科技，2012，（4）：29-31.

［4］冯世江.定向合成GAMG的菌株筛选及其催化特性研究［D］.石河子：石河子大学，2006.

［5］谢辉.18-β甘草次酸的研究进展［J］.中成药，2002，24（9）：712-713.

［6］张怡红.离体培养的肠道菌群对黄山药总皂苷的代谢研究［D］.广州：广东药学院，2008.

DETERMINATION OF GLCYRRHETINIC ACID CONTENT IN THE PROCESS OF YEAST STRAIN YGL-B-0 TRANSFORMING GLYCYRRHIZIC ACID

ZHOU Yan-yan， ZHANG Lin， LIU Pei， et al

(Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective： To determine the glcyrrhetinic acid content in the process of yeast strain YGL-B-0 transforming glycyrrhizic acid by HPLC.Methods： ZORBAX SB-C18column （2.1×150mm， 3.5μm） and ZORBAX SB-CB pre-column （2.1×12.5mm， 5μm） were used in this study： column temperature was 28℃， mobile phase was methanol： acetonitrile：0.5% formic acid=20：40：40（V/V）， fl ow rate was 0.2ml/min， detection wavelength was 250nm.Results：The linearity range of glycyrrhetinic acid was 0.1-1.6μg （r=1.0000）.The average recovery rate of glycyrrhetinic acid was 99.6 %-101.9%； RSD was respectively 1.21%， 2.13% and 1.70%（n=3）. The average content of glycyrrhetinic acid was 11.70mg/ml after the yeast strain YGL-B-0 culture fermentation for 72h.Conclusions：The method in this study was simple and feasible， with good reproducibility and strong specifi city. It can be used for determination of glycyrrhetinic acid in the process of yeast strain YGL-B-0 transforming glycyrrhizic acid.

Yeast strain YGL-B-0； Content determination； Glycyrrhetinic acid； Best fermentation conditions

R927.2

A

1004-6879（2015）01-0003-03

2014-07-26）

* 河北省自然科学基金项目（H2014406036），河北省高校重点学科“中药学”资助△ 通讯作者