高效液相色谱法测定饲料中己烯雌酚含量的方法学考察

王东伟，陈建华，周 磊

（1.公安部警犬技术学校，辽宁沈阳 110034；2.辽宁省沈阳市兽药饲料监察所，沈阳 110031；3.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050）

高效液相色谱法测定饲料中己烯雌酚含量的方法学考察

王东伟1，陈建华2，周 磊3

（1.公安部警犬技术学校，辽宁沈阳 110034；2.辽宁省沈阳市兽药饲料监察所，沈阳 110031；3.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050）

己烯雌酚是一种人工合成的雌性激素，被禁止添加在畜禽饲料中，人们长期食用这种含有雌激素的畜禽、鱼虾等，可以在人体内引起蓄积，引发一系列的健康问题。应用BP028—2002高效液相色谱法可以快速检测到饲料中己烯雌酚的微量含量。此方法经过大量的试验操作，方法摸索，方案优化，具有灵敏度高、检测时间短、回收率高等优点。

高效液相；色谱柱；色谱峰；己烯雌酚；回收率

己烯雌酚（diethylstilbestol，DES）别名乙底酚，是人工合成的非甾体雌激素物质，能产生与天然雌二醇相同的所有药理与治疗作用。小剂量己烯雌酚可刺激垂体前叶促性腺激素，大剂量则抑制垂体前叶促性腺激素和促乳素的分泌，有抵消雄激素并抑制催产素酶而增强催产素的作用。己烯雌酚添加到饲料中主要发挥提高产崽率或催情作用，人食用含有己烯雌酚的动物制品后造成体内激素失调，从而给健康带来危害。2002年我国农业部规定己烯雌酚禁止在饲料中添加使用，2003年农业部规定己烯雌酚在可食性动物组织中不得检出。笔者等采用外标法建立了饲料中己烯雌酚的高效液相色谱法检测方法，适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中己烯雌酚的测定。

1 材料

1.1 仪器、试剂与药品

高效液相相色谱仪，日本日立公司。己烯雌酚标准品，含量99.9%，批号SZBA110X，SIGMA-ALORICH公司产品；甲醇为色谱纯。提取液：80%甲醇溶液，水为屈臣氏纯净水。抗坏血酸，乙酸乙酯，三氯甲烷，1 mol/L氢氧化钠溶液。

1.2 色谱条件

色谱柱为C18（6.2 mm×150 mm，5 μm）；流动相为0.043mol/L磷酸二氢钠:甲醇=30:70（用磷酸调节pH=5），流动相过0.45 μm有机滤膜。流速1.0 mL/min；进样体积20 μL；柱温25℃。

1.3 标准储备液的配制

准确称取0.025 g己烯雌酚标准品，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分摇匀，配制成1 mg/mL储备液，密封，-20℃保存。

1.4 标准中间工作液的配制

用移液器取一定量的储备液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即为50 μg/mL己烯雌酚标准工作液，密封，4℃保存备用。

1.5 样品前处理

取饲料10 g（准确至0.001 g）和抗坏血酸2 g，置于50 mL离心管中，加乙酸乙酯适量，充分振荡约1 min，再置于超声仪中超声提取2 min，期间用手回摇2次，取出后以4000～5000 r/min离心，倾出上清液，再分别加适量乙酸乙酯提取2次，合并上清液，置旋转蒸发器上，68～72℃减压蒸发至干。

将蒸发的乙酸乙酯提取物用三氯甲烷溶解，分3次定量转移至150 mL的分液漏斗中，加少许抗坏血酸（0.3～0.5 g），用氢氧化钠10 mL将DES萃取至水相。回旋震荡30 s，并用三氯甲烷洗涤2～3次，每次20 mL，回旋振荡10 s，然后用碳酸氢钠溶液12～15 mL将pH值调至10.3～10.6，再用30、30、20 mL三氯甲烷萃取3次，将DBS回提至三氯甲烷中，并令三氯甲烷层通过无水碳酸钠干燥。将干燥过的三氯甲烷溶液置于旋转蒸发器上，在55～57℃、减压蒸发至干，以适量甲醇溶解后，上样测定。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制

分别准确吸取一定量的标准工作液（50 μg/mL），用流动相稀释成0.3、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/mL的标准溶液，分别进样20 μL，得到峰面积。以浓度和峰面积分别为横坐标和纵坐标，绘制标准曲线，采用外标法定量。

2.2 线性关系考察

准确量取适量标准储备液，用甲醇稀释成浓度分别为0.00、0.3、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/mL的对照品溶液，按照“1.2”色谱条件进行高效液相色谱分析。检测结果表明，己烯雌酚在0.3～16.0 μg/L范围内线性关系良好，线性方程为y=31355x-186.89，相关系数R2=1.00，见图1。

图1 己烯雌酚标准曲线

2.3 回收率测定

根据BP028—2002、农业部193号公告，制定饲料浓度点为20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg（每个浓度设5个重复），依次添加的目标化合物分别为（称样量为10 g）200、400、800 μg，取适当浓度的储备液或工作溶液进行添加。测定结果见表1，回收率和变异系数表明本方法适用于饲料中己烯雌酚的测定。

表1 饲料中己烯雌酚回收率测定结果

2.4 空白试验结果

按照“1.2”色谱条件分别进样，进行高效液相色谱分析，所得空白样品色谱图、空白试验色谱图（不加样品）、空白样品加样图分别见图2～4。

图2 空白样品HPLC色谱图

图3 空白实验HPLC色谱图

图4 空白样品加标HPLC色谱图

2.5 精密度试验

选择20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg浓度样品，按照“1.2”色谱条件进行高效液相色谱分析，每个浓度设6组重复，测定结果见表2。结果表明，饲料中己烯雌酚在20～80 mg/kg浓度范围内，变异系数和精密度较好（RSD≤15%）。

表2 精密度试验结果

2.6 定量限、检测限

按照本标准，检测限0.25 mg/kg。标准曲线中的最低点0.3 μg/mL，甲醇溶液100 mL，稀释倍数100倍，所以测定最低浓度点为0.3 μg/mL×100 mL/10 g=3 μg/g。

3 结论

该方案根据是BP028—2002、农业部168号公告而设计的。检测结果表明，该方法的前处理方法操作简单、快速、准确，回收率、重复性、检测限均能满足饲料中己烯雌酚残留检测的要求。

［1］ 吴红军，成强，臧素娟，等.高效液相色谱法测定水产品中己烯雌酚的残留量［J］.安徽农业科学，2014，42（14）：4447-4448.

［2］ 韩迪，张艳，周建于，等.超高效液相色谱串联质谱法检测鸡肉中5种雌激素残留［J］.昆明医科大学学报，2014，35（7）：32-36.

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S816

A

2095-3887（2015）06-0074-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.024

2015-10-09

王东伟（1979-），男，助理研究员，硕士。

周磊（1979-），男，助理研究员，硕士，从事畜牧生产系统管理工作。