福建白兔非特异性抗病特性研究

陈冬金，陈岩锋，孙世坤，桑 雷，谢喜平，张丹青

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州 350013）

福建白兔非特异性抗病特性研究

陈冬金，陈岩锋，孙世坤，桑 雷，谢喜平，张丹青

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州 350013）

取90日龄福建白兔24只（雌雄各半），测定其血清中的免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量和补体C3、C4含量，以及外周血中淋巴细胞转化力和中性粒细胞吞噬力。结果表明：福建白兔的免疫球蛋白IgG、IgM含量分别为2 208.75 mg/L和289.71 mg/L，补体C3、C4含量分别为87.46 mg/L和36.54 mg/L，淋巴细胞刺激指数1.50，中性粒细胞吞噬率58.39%，中性粒细胞吞噬指数2.22，白细胞数4.23×109/L，红细胞5.05×109/L，且雌雄兔差异不显著（P＞0.05）。测定结果可为福建白兔非特异性抗病力的选择以及非特异性抗病育种提供依据。

福建白兔；免疫球蛋白；补体；淋巴细胞转化率；中性粒细胞吞噬率

据1985年出版的《福建省家畜家禽品种志和图谱》调查显示，福建地方家兔有黄色毛、黑色毛、白色毛3个种群［1］。福建黄兔和闽西南黑兔分别于2006年和2010年被列入国家畜禽遗传资源目录［2-3］。福建白兔属小型肉用地方兔资源，全身被毛白色，头部清秀，两耳直立，眼虹膜红色，身体结构紧凑，于2014年通过了国家畜禽遗传资源专家委员会认定。福建白兔主要分布在福建省武平县，是福建省地方优良品种之一，该品种具有繁殖性能良好、耐粗饲、抗病力强、肉质好、市场畅销等特点。目前对福建白兔的研究主要是对其血液生理生化［4］、种质特性和生产性能［5］、肌肉营养成分［6］的研究等，对其抗病特性的研究报道鲜见。

据养殖户普遍反映，福建白兔具有抵抗力强、发病少的特点，有望成为抗病育种优良的素材。抗病育种是当前畜禽育种的研究热点，对抗病力进行度量和抗病力遗传机制的研究是其中的研究重点和难点。据Axford等［7］和Bishop等［8］报道，家畜对普通和特殊传染病的抗性都具有品种间的差异。但目前对动物抗病力的测定较为困难，因此育种学家常常忽视对这类性状的选择。个体免疫力是衡量动物抗病能力的重要指标，由于免疫功能易于度量测定，因此免疫指标可作为抗病力的间接指标［9］。对家畜的免疫应答选育研究已经广泛开展，尤其在猪和禽中研究较多［10-12］。笔者等通过测定福建白兔的体液免疫指标和细胞免疫指标，为福建白兔的抗病特性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 福建白兔，在武平县武东乡袁田村兔场随机选择90日龄育成兔24只（雌雄各半），自由采食、饮水，环境温度18～25℃。

1.1.2 主要仪器 BECKMAN AU2700全自动生化分析仪，Sysmex XT-1800i全自动血液分析仪，三洋CO2培养箱，酶标仪，LEICA DM750生物显微镜，湖南湘仪TGL-16M高速冷冻离心机，真空采血管（EDTA-K2抗凝管），普通采血管，96孔培养板，离心管，移液器，等等。

1.1.3 主要试剂 肝素，小牛血清、Hank’s液，兔淋巴细胞分离液，台盼蓝，PHA，CCK-8（Cell CountingKit 8，碧云天公司），等等。

1.2 方法

1.2.1 福建白兔血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM和补体C3、C4含量测定［13］空腹前腔静脉采血2 mL于干净的真空采血管中，静置30 min，3 500 r/min离心15 min，吸取上清液于干净的PE管中，然后封口置于-20℃低温冰箱中保存，待测。通过BECKMAN COULTER AU2700大型全自动生化分析仪、宁波康美生化试剂盒及采样免疫透射比浊法对福建白兔血液免疫球蛋白IgM、IgG和补体C3、C4含量进行测定。

1.2.2 福建白兔外周血淋巴细胞转化实验［13］无菌取静脉血2 mL，置于含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2 mL Hanks溶液进行对倍稀释，混匀。用吸管吸取稀释血液，沿试管壁缓缓加到含有2 mL淋巴细胞分离液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面。试管以2 000 r/min水平式离心20 min后小心取出，管内可分为4层：上层为血浆、血液稀释液和绝大部分血小板，下层为红细胞及粒细胞，中层为细胞分层液，分层液与血浆交界部位浑浊的灰白色层即为单核细胞层。用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层，用Hanks溶液洗涤2次，每次以1 500 r/min离心10 min，弃上清，加RPMI-1640培养液1 mL混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。

CCK-8（Cell CountingKit-8）法：原理同MTT法。于96孔细胞培养板分别加入分离好的淋巴细胞悬液100 μL/孔（终浓度为3.5×106个/mL），试验孔加入PHA 16 μL/孔，对照孔加入1640培养液，每一血样设3个重复，加盖，于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养68 h。每孔加入CCK-8 10 μL，继续培养1 h，于酶联免疫测定仪上测定OD450值，以SI（刺激指数）值反映淋巴细胞转化率，SI计算公式如下。

SI=试验孔OD值均值/对照孔OD均值

1.2.3 福建白兔外周血中性粒细胞吞噬力测定［14］取肝素抗凝血2滴（约0.2 mL）于装有葡萄球菌培养物（0.1 mL，12亿/mL）的小管中，混匀，37℃作用10 min，取少量置于载玻片上，推成薄血片（每只兔3片），干燥。瑞氏染色，油镜观察。参照《全国临床检验操作规程》，随机计数200个中性粒细胞，分别记录吞噬细菌的细胞数和每个中性粒细胞吞入的细菌数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。

1.2.4 福建白兔血液白细胞分类计数 空腹耳缘静脉采血1～2 mL至EDTA-K2抗凝的真空管（采血前试验动物禁食12 h，同时让其自由饮水，在清醒状态下进行耳静脉采血），轻弹管底，使血液充分抗凝，并避免溶血。采用SysmexXT-1800i全自动血液分析仪，用标准常规方法对样品中白细胞分类计数指标进行测定。

1.2.5 数据处理 将测定数据用生物学统计软件SPSS 13.0进行统计分析，结果用平均数±标准差（±SD）表示，并进行两独立样本t检验，比较福建白兔雌雄之间免疫指标的差异。

农民按照城镇化规律集中居住是落实乡村振兴战略的有效抓手，也是符合农民意愿的实践探索。因集中居住产生的新型农村社区，既有传统乡土社会的传承，也有现代城市社会的特点。加强新型农村社区党建工作，是适应农业结构调整、农民集中居住、农村发展变化的必然要求，也是完善农村治理体系，巩固党在基层执政根基的内在要求，需要运用好“融”理念，使基层党组织始终在乡村治理体系中处于核心地位，发挥引领作用。

2 结果

2.1 福建白兔血清中免疫球蛋白和补体含量测定

福建白兔免疫球蛋白IgG、IgM（由于IgA含量较低，未能检测出）和补体C3、C4含量测定结果见表1，结果显示，雌雄兔上述指标差异均不显著（P＞0.05）。

表1 福建白兔血清中免疫球蛋白和补体含量mg/L

2.2 福建白兔外周血淋巴细胞转化率和中性粒细胞吞噬力测定

从表2可知，雌雄兔淋巴细胞刺激指数、中性粒细胞吞噬率、吞噬指数以及白细胞数等均无显著性差异（P＞0.05）。

表2 福建白兔外周血淋巴细胞转化率和中性粒细胞吞噬力

2.3 福建白兔血液白细胞分类计数

从表3可以看出，雌雄兔红细胞、白细胞以及白细胞中的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等均无显著性差异（P＞0.05）。

表3 福建白兔血液白细胞分类计数结果

3 讨论与小结

3.1 测定年龄

一般认为，动物在一定的年龄阶段各项免疫指标的正常值基本恒定，在年龄、性别、饲养条件等基本相同的情况下，其在正常范围内波动，但幅度不大。卿柳庭等［15］报道了7～11周龄猪免疫指标，其中在此阶段猪的各项免疫指标已经稳定在成年猪的正常范围之内，具备了较稳定的免疫反应。本实验根据福建白兔的生长特点，选择90日龄的福建白兔作为实验动物。

3.2 免疫指标的选择

机体免疫功能通过细胞免疫与体液免疫实现。体液免疫是由B淋巴细胞系产生的抗体参与免疫应答；细胞免疫是指由T淋巴细胞识别抗原引起的，并由效应T淋巴细胞和巨噬细胞介导的免疫应答［16］。

本实验测定的体液免疫指标包括免疫球蛋白IgG、IgM、IgA和补体C3、C4。抗体是一种免疫球蛋白，其水平是反映动物机体免疫功能的重要指标［17］。根据免疫球蛋白的特性和抗原性将其分为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中IgG、IgM、IgA是介导体液免疫的主要效应分子。IgG由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生，存在于所有体液内，是动物自然感染和人工主动免疫后机体所产生的主要抗体，发挥着抗病毒、抗菌、抗毒素的免疫学效应，是人和动物血清中含量最高的免疫球蛋白［18］。IgM由初次体液免疫反应产生，含量仅次于IgG，通常仅存在于血液内，发挥抗原受体的作用［19］。IgA是外分泌液中的主要免疫球蛋白，在保护呼吸道、泌尿生殖道、肠道、乳腺和眼睛抵抗微生物入侵方面起关键作用，能凝集颗粒性抗原和中和病毒［20］。本实验中由于IgA含量太低，未检测出来。补体系统是体内重要的免疫效应和免疫效应放大系统，发挥机体特异性和非特异性的抗感染作用，除参与入侵病原体和循环免疫复合物的清除外，也可造成机体组织损伤，因而补体的含量相对稳定，其活化和抑制通过多种补体分子严格控制［21］。

细胞免疫主要是通过测定白细胞数、红细胞数、淋巴细胞转化率、中性粒细胞吞噬率、中性粒细胞吞噬指数等。白细胞具有吞噬和破坏侵入机体病原体的功能，主要参与非特异性免疫活动，当白细胞总数减少时，可以引起机体对病原体抵抗力降低，因此，检测白细胞总数可以反映机体抵抗力的变化［22］。红细胞既有携氧、运输气体、调节体内的酸碱平衡等功能，又具有识别抗原、消除免疫复合物的免疫调节功能［23］，红细胞可以分化成为两类干细胞，一类是髓系干细胞，另一类是淋巴干细胞，故其在机体免疫应答中也起着十分重要的作用［21］。

机体的免疫状况与血液中T淋巴细胞密切相关，测定T淋巴细胞数量变化可以了解机体的免疫状况［24］。淋巴细胞转化率是评价细胞免疫功能的一个重要指标。淋巴细胞的体外增殖测定方法很多，目前主要有形态观察计数法、3H-胸腺嘧啶掺入法、MTT法和CCK-8法。本实验采用CCK-8（Cell CountingKit-8）法原理同MTT法，重复性好，灵敏度高，对细胞的毒性低，结果可靠准确，取得了预期效果。

3.3 小结

本实验所测福建白兔的指标均在常规的饲养管理与免疫水平下，福建白兔的免疫球蛋白IgG、IgM含量分别为2 208.75 mg/L和289.71 mg/L，补体C3、C4含量分别为87.46 mg/L和36.54 mg/L，淋巴细胞刺激指数1.50，中性粒细胞吞噬率58.39%，中性粒细胞吞噬指数2.22，白细胞数4.23×109/L，红细胞5.05×109/L，且雌雄兔上述指标均差异不显著（P＞0.05）。本实验初步建立了福建白兔免疫指标的正常值，间接反映了福建白兔的抗病特性。

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Study on General Resistance Characteristics on Fujian White Rabbits

Chen Dongjin,Chen Yanfeng,Xie Xiping，et al
（Institute ofAnimal Husbandryand VeterinaryMedicine,Fujian AcademyofAgricultural Sciences,Fuzhou 350013,China）

In order to explore the resistance characteristics of Fujian white rabbit，twenty-four 90-day-old rabbits（half male，half female）were selected to determine the content of immunoglobulin IgG，IgM，IgA in serum,complement C3，C4and the peripheral blood lymphocyte transformation and thephagocytosis ability of neutrophil.The results showed that the content of immunoglobulin IgG，IgM were 2 208.75 mg/L，289.71 mg/L，complement C3，C4content were 87.46 mg/L，36.54 mg/L，lymphocyte stimulation index was 1.50 and neutrophil phagocytic rate was 58.39%，neutrophil phagocytic index was 2.22，white cell amount 4.23×109/L，red cell amount 5.50×109/L；no significant difference（P>0.05）were found between the male and the female.The results would be useful as a reference in the breeding selection.

Fujian white rabbit;immunoglobulin;complement;lymphocyte transformation rate;neutrophil phagocytic rate

S829.1

A

2095-3887（2015）06-0034-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.011

2015-07-10

国家现代农业（兔）产业技术体系（CARS-44E-11）；福建省公益类科研院所专项（2014R1101002-3）

陈冬金（1981-），女，助理研究员。

谢喜平（1966-），男，研究员。研究方向：草食动物遗传育种与饲养。