人工饲养背摇蚊幼虫龄数和龄期的测定

王雪龙，陈再忠*，高建忠，黄志坚，雷邦雄，王 磊

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306;2.共鳞实业(深圳)有限公司，深圳 518115)

背摇蚊Chironomus dorsalis 隶属于双翅目Diptera 长角亚目Nematocera 摇蚊科Chironomidae摇蚊属Chironomus。摇蚊科为水生昆虫中分布最为广泛的一个科(Ferrington，2008)，在各类水体中均有广泛分布，数量较大，其生物量约占底栖生物量的70%-80% (Armitage et al.，1995)，其幼虫统称摇蚊幼虫，俗称血虫、红虫 (李明，2008)。摇蚊幼虫营养丰富，其干物质中，蛋白质含量为41%-62%，脂肪为2%-8%，是多种经济水生动物如鱼、虾、蟹、龟、鳖等的优良天然饵料(钟诗群，1997)。在水产养殖中，渔民常捕捞红虫来饲喂经济鱼类，随着养殖业的发展，红虫的需求量也越来越多，而且对品质的要求越来越高。因此对红虫的基础学研究，特别是对分类、形态和发育等研究领域具有重要意义。

日本、美国等自30年代起已对摇蚊生物学特性进行研究，并在50年代开始了背摇蚊的人工繁殖及工厂化培养试验(代田昭彦，1968)。前苏联从1951年起，已有专门培养背摇蚊幼虫的工厂，生产活饵喂养幼鲟鱼(淡水生物学，1982)。1961年，日本的代田昭彦对背摇蚊幼虫的培育及人工采卵等方面做了详细研究，使其取得一定进展。国内相关研究中对摇蚊生物学基础较缺乏，一个突出问题是难以准确鉴定摇蚊种类 (吴昊等，2012)。而我国有关摇蚊的研究甚少，且集中在幼虫的分类鉴定工作(欧阳怡然等，1984;谢祚浑，1988;齐鑫和王新华，2010;杜炫发等，2013)，毒理学研究(赵燕等，2012;张丹等，2014)，水系统的污染防治(孙兴滨等，2005;莫文婷，2007;孙兴滨和崔福义，2007)等方面。

摇蚊的生物学特征被利用在许多不同的领域中，比如种群动态(Beaudouin et al.，2014)、生态作用(Frouz et al.，2009)、分类学(Trivinho-Strixino，2011)、影响环境的指示生物(Di Veroli et al.，2012)和毒性测定的试验生物 (U.S.Environmental Protection Agency，2000)。为了应用于这些研究，确定种群的年龄组成很重要，而这取决于幼虫龄期区分的能力 (Di Veroli et al.，2008)。形态学在昆虫龄期鉴定中是一种广泛的鉴定工具(Daly，1985)。鉴定幼虫龄期最广泛利用的尺寸就是腹面观 (Mccauley，1974;Trivinho-Strixino and Strixino，1982)，头壳的宽度(Ecole et al.，1999;Silva et al.，2008)和长度。本文通过8项指标参数，采用了合理的统计学方法，对摇蚊幼虫的龄数和龄期研究进行规范，有比较重要的学术意义。

1 材料与方法

1.1 幼虫的收集与饲养

2014年5月，试验组从上海浦东新区滨海养殖基地(31°00'N，121°53'E，海拔6 m)内的池塘边收集未孵化的背摇蚊卵袋1 枚，带回实验室置于透明塑料框中饲养(尺寸大小:长×宽×高=30 cm×30 cm×5 cm)，塑料框置于28℃恒温水浴锅(HH-S4 数显恒温水浴锅，常州普天仪器制造公司)内，光照周期为L ∶D=12 ∶12。采集池塘底泥经200 目筛网过滤后平铺于塑料筐内，底泥厚度5 mm 左右，水位2 cm 并加气泵充氧。1 d 后可观察到有幼虫已经孵出，从背摇蚊幼虫孵化之日(2014年5月29 日)起，每天8 ∶00、20 ∶00 各取样一次，每次随机采集一定数量的背摇蚊幼虫，投入75% 乙醇中保存 (Annelle and Constance，1982;王小艺等，2012)，贴上标签，注明采集日期，直至幼虫全部化蛹(2014年6月20 日)为止。每次采集幼虫之后滴喂数滴纯牛奶供其补充营养。

将收集的幼虫做成临时标本:从75%乙醇中取出幼虫放在8% NaOH 溶液中，置于37℃摇床(THZ-92B 气浴恒温振荡器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)振荡5-8 h，然后用蒸馏水清洗数遍，将其身体腹部向上置于载玻片上，滴一滴Hoyer's 溶液(王俊才和王新华，2011)封片，并在显微镜(Nikon DS-Ri1)下观察拍照，测量并记录各形态指标数据，试验共收集不同龄期的幼虫238 头。

1.2 可量性状的选择及测量

背摇蚊幼虫各形态特征描述参考王新华(2011)。通过观察不同龄期的摇蚊幼虫形态特征，选择背摇蚊幼虫身体骨化程度较高的8个部位(图1)作为分龄形态指标，这8 项形态结构分别是:Y1-头壳长，Y2-颏中齿顶端至冠突前缘间距离，Y3-头壳宽，Y4-颏宽，Y5-颏中齿宽，Y6-触角长，Y7-触角基节长，Y8-触角比(触角基节与其余各节的长度之比)，然后通过比较分析得出背摇蚊幼虫最佳分龄指标。

图1 背摇蚊幼虫分龄的8个测量指标Fig.1 Eight variables used for distinguishing instars of larval Chironomus dorsalis

将制作的临时标本放在显微镜下将幼虫需测量的各个形态结构拍成JPG 格式图片，配合图像测量软件(TSView Version 7.1)测量不同结构的数据。

1.3 数据统计分析方法

根据测量数据，使用SPSS Statistics 19.0 统计分析软件制作频次分布表和频次分布图，数据频次分布统计的最佳组数与组距确定方法参考李秀枝(1994)。龄数划分后，再根据测定值计算各龄幼虫测量指标Y1-Y8的均值、标准误差及变异系数(王小艺等，2005)，根据Dyar 定律和Crosby 生长法则计算Brooks 值和Crosby 值。然后对分龄数据进行回归分析，从而得到用于背摇蚊幼虫分龄的最佳形态指标。

Dyar 定律认为相邻龄期的幼虫，其骨化部位是以一定的几何级数方式增长的 (Chapman，1998;彩万志等，2001)。Crosby 生长法则认为，Crosby 指数大于10%表明分龄指标的分组不合理(Loerch，1983)。应用Brooks 指数、Crosby 指数和线性回归的方法验证分龄的合理性(孙艳娟等，2009)。

Brooks 指数=Xn/Xn-1(xn和xn-1分别表示n龄和n-1 龄幼虫各个测量指标的平均值)。

Crosby 指数=bn-bn-1/bb-1(bn和bn-1分别表示第n 和n-1个Brooks 指数)。

幼虫种群众数龄期的计算方法参考戴志一(1980)，统计不同日期各龄幼虫的数量，计算其相对应的发育进度(累计百分率)，将累计百分率转换为机率值，以机率值为纵坐标，发育时间为横坐标，计算相邻2个龄期间累计百分率为50%时日期差即为前一虫龄的众数龄期。

2 结果与分析

2.1 背摇蚊幼虫龄数划分

由于摇蚊一龄幼虫在自然界很难获取，再加上幼虫种类鉴定的困难程度，故本实验选择田间采集背摇蚊卵袋，带回实验室进行孵化培养，定期收集并保存一定数量的摇蚊幼虫，对骨化程度较高的形态结构进行测量。将测量所得的8 组数据分别输入SPSS Statistics 19.0 统计分析软件，进行描述统计，在概率模板中制作频次分布图(图2)。观察频次分布图可看到频次集中的几个区域，一个集中区域就代表一个龄期 (张海滨等，2011)。

从图1 可以看出，Y1-Y7 均明显出现了相对集中的4个频次分布集中区和4个高峰，分为4 龄;Y8 也出现了4个集中区域，但不明显，分为4 龄。上述判断仅为初步判断，还需通过Crosby指数分析和回归分析来验证其合理性。

2.2 Crosby 指数分析

针对8 种不同的形态结构数据，依次计算各个龄期的数值变幅、均值、样本数、变异系数以及Brooks 指数和Crosby 指数(见表1)。

图2 背摇蚊8 项形态参数测量值频次分布图Fig.2 Fruquency histograms of variable used of determining larval instars of Chironomus dorsalis

表1 背摇蚊幼虫分龄的8 项指标测量值的数据统计结果Table 1 Measurements and statistics of eight indicators of Chironomus dorsalis

从表1 发现，Y8的Crosby 指数显著大于其他结构，因此Y8 最先淘汰。其他7 组结构在龄数划分时，相邻龄数的指标测量值之间没有发生重叠，是比较理想的分龄指标。而且，这7 项指标的变异系数在0.0285-0.1760，均小于20%。Y1-Y5、Y6的Brooks 指数在1.4-1.9，符合统计要求。其中Y1-Y4、Y6 等5 项指标的Crosby 指数均小于10%，表明将背摇蚊幼虫划分为4 龄是合理的(王小艺等，2012)。

2.3 背摇蚊幼虫各龄可量性状与龄数关系拟合

对背摇蚊幼虫各项分龄指标实测平均值与相应龄数之间关系进行回归分析。结果表明8 组数据的实测值与龄数之间符合Dyar 氏法则所描述的指数关系。经检验，回归曲线均达到极显著水平(见表2)。从表2 可以看出，除了Y7 和Y8 两项指标的相关系数较小，分别为0.9843 和0.9789，其他6 项指标的相关系数均在0.99 以上，表现为极显著相关。而且，Y1-Y6 在频次分布中清晰的出现了4个峰，由此可知，将背摇蚊幼虫划分为4 龄更为合理。其中Y6 (触角长)的Crosby 指数最小，变异系数最小，相关系数最大，因此Y6 是最佳分龄结构。其次是Y2 (颏中齿顶端至冠突前缘间距离)和Y4 (颏宽)也可以作为分龄的辅助和验证指标。

表2 背摇蚊幼虫8 种可量性状测量值回归方程及相关系数Table 2 R2 and the linear formula of larval instars and eight morphological sructures of Chironomus dorsalis

表3 背摇蚊幼虫各龄幼虫的龄期Table 3 Stadia of Chironomus dorsalis larvae

2.4 背摇蚊幼虫各龄的龄期

确定了背摇蚊幼虫的龄数后，根据划分幼虫龄数最可靠的指标Y6 (触角长)进一步统计不同日期各龄幼虫的数量及其发育进度 (累计百分率)，再将百分率转换为机率值(y)后与调查日期作线性回归分析，卵孵化与幼虫第一次蜕皮进度的回归直线机率值中值所对应的调查日期之差即为1 龄的众数龄期(邵景文等，2001)，以此类推，可以求得其他各龄幼虫龄期 (见表3)。1-4 龄幼虫龄期分别为1.32 d、2.00 d、7.51 d和8.39 d，幼虫总历期为19.22 d。

3 结论与讨论

3.1 龄数确定和龄期判定

国外有关摇蚊幼虫龄数和龄期的研究已见诸多报道，而国内相关研究极少。Oliver (1971)和Mccauley (1974)提出摇蚊幼虫普遍具有四龄，除了极少数种类。例如，Berg (1950)发现Cricoto flavipes Joh.、Glyptotendipes dreisbachi Joh.和耐垢多足摇蚊Polypedilum (pentapedilum)sordens (v.d.Wulp)等种类的幼虫仅具有3 龄。Styczyński 和Rakusa-Suszczewski (1963) 报 道:Cricotopus humeralis Zett.和寄莼直突摇蚊 Orthocladius consobrinus Holmg 等种类的幼虫具有5 龄。Peckman(1971)报道:Belgica antarctica Jacobs 种类的幼虫具有6 龄。Kettisch (1936)提出三带环足摇蚊Cricotopus trifasciatus (Panz.)种类的幼虫具有7 龄。

本研究采用8 项形态指标，运用Dyar 规律、Crosby 指数及回归分析后均得出，背摇蚊幼虫具有4 龄，并计算出了各龄幼虫和整个幼虫的众数龄期。从龄期数据来看，1 龄幼虫历时最短(1.32 d)，3 龄幼虫历时稍长(7.41 d)，4 龄幼虫历时最长(8.39 d)，这与王俊才(2011)描述相一致。本研究中，各龄幼虫测量指标值与龄数呈现指数关系，即背摇蚊幼虫的生长发育呈几何级数增长，符合Dyar 规律(Chapman，1998)。而且，相邻龄期之间指标测量值并没有发生重叠，用来判定龄期非常可靠。

3.2 可量性状的选择

由于幼虫本身收缩、食物、环境条件等不同因素对其影响较大，故以幼虫体长、体宽作为分龄依据，其准确度较低(宗世祥等，2006)。Victor和Mccauley (1974)研究了头壳长与头壳宽来确定幼虫龄期。Annelle 和Constance (1982)选取了触角，下颌骨，颏中齿，颏和腹颏板等5个形态结构作为龄期区分的指标。Vinicius 等(2013)研究了5 项用于形态分析的结构，分别为:触角，下颌骨，颏，腹颏板以及颏中齿顶端至冠突前缘间距离，并提出了将腹颏板条纹数目作为确定幼虫龄期的替代方式。而本研究选取了容易测量且骨化程度较高的8 种形态结构作为分龄指标，有利于龄期判定。其中，头壳长与头壳宽是最常用的结构，也已经被许多学者所研究 (Victor and McCauley，1974)，然而在测量过程中，头壳经常破损或者压扁(Annelle and Constance，1982)，给测量结果带来较大偏差。背摇蚊幼虫的触角具有五节，每一小节连接处会有所弯曲，加上触角颜色较透明，有时对测量部位的起止位置观察不清，而影响测量;颏中齿与颏在测量过程中是最容易观察清楚的。测量结果表明，触角长是最佳分龄指标，颏中齿顶端至冠突前缘间距离和颏宽的测量结果也足够敏感去判定背摇蚊幼虫的龄期，此3 种结构分龄的可靠性高于其他几项。

3.3 影响龄数的因素

许多因素比如温度、光周期、高密度、食物数量和质量都可以改变幼虫发育和昆虫的尺寸(Canteiro and Albertoni，2011)。暴露于化学污染物下也可能会导致龄数的变化或者影响幼虫形态结构的尺寸 (Victor and McCauley，1974)。正如Hamilton 和Sæther (1971)发现在重污染地区收集的幼虫会出现严重的畸形。Trivinho-Strixino 和Strixino (1982)在不同的实验室条件下，获得同一种摇蚊幼虫的结果相比较得出，幼虫发育时间具有显著差异，但是头壳腹面观的长度在每一龄期都是连续的。因此，非生物因素主要影响龄期的持续时间，但是不会明显影响头壳的尺寸，以至于不能区分龄期 (Vinicius et al.，2013)。Chironomus tepperi Skuse 幼虫在野外和实验室饲养的温度分别为17.5℃和25.0℃，但却拥有相似尺寸的头壳，即温度变化尚不能引起龄期测量的不同。因此，实验室研究可以应用于野外研究(Stevens，1993)。

本研究所需的背摇蚊幼虫都是在一致的实验室条件下，采用粘土-牛奶培养基(代田昭彦，1968)饲养而得。以往分龄研究所采集的幼虫大多来自野外(Styczyński and Rakusa-Suszczewski，1963;Peckman，1971;Victor and McCauley，1974;Annelle et al.，1982)，也有人工饲养而得到(Berg，1950;Vinicius et al.，2013)。野外环境下由于受到天敌及环境等复杂外界因素的影响，幼虫的生长差异性大，不利于数据统计分析。而相同条件下室内人工饲养的幼虫在形态结构方面具有高度的一致性，数据分析结果更为可靠(张海滨等，2011)。

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