分光光度法测定虾青素

张泳,厉妙沙,吴嘉圣

(上虞新和成生物化工有限公司,浙江上虞312369)

分光光度法测定虾青素

张泳,厉妙沙,吴嘉圣

(上虞新和成生物化工有限公司,浙江上虞312369)

建立一种快速测定化学合成虾青素含量的分光光度分析方法。采用经氢醌处理的三氯甲烷做为提取溶液,在489 nm波长下测定吸光度,该分光光度法的标准曲线回归系数是0.9999,相对标准偏差为0.36%,加标回收率为99.8%～102.5%,表明该分析方法准确性高、重复性好,且简便、快速,可以作为企业大批量生产中虾青素的测定方法。

虾青素;分光光度法;化学合成

0 概述

虾青素是一种广泛存在于生物体的非维生素A源类胡萝卜素。在水生动物虾、蟹、鱼和鸟类的羽毛中发挥调节色素沉积并显色的作用。虾青素被广泛应用于鱼虾等水产养殖动物的饲料添加剂,以补充人体内虾青素的缺乏。虾青素是类胡萝卜素合成的最高级别产物,具有明显的抗氧化、消除活性单线态氧的作用。因此在食品、化妆品、保健品领域也有着广泛的应用前景[1]。

从动植物及菌类中提取的虾青素,由于其虾青素含量较低及检测限值低的原因,基本采用液相色谱分析法。而目前市场上鱼饲料中的虾青素90%是化学合成得到,国内尚未见有系统的对化工合成的虾青素含量检测的研究报道。本文研究参考国外对虾青素理化性质的报道,采用紫外分光光度法对化学合成虾青素的含量进行检测,结果满意可行。

1 实验部分

1.1 实验原理

虾青素是由四个异戊二烯单位以共扼双键形式链接,两端又有两个异戊二烯单位组成六节环结构的化合物,虾青素分子结构中的这种共扼双键体系及离域化的π电子,在可见光区表现出强吸收带,且每种类胡萝卜素分子的最大吸收峰位置与紫外可见光光谱的精细结构都是具有特征性的。由于类胡萝卜素分子的这种光吸收性质,溶液中的类胡萝卜素一般服从beer-lambert定律,所以通过分光光度法可以实现对虾青素精确的定量分析[2]。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 实验仪器

UV8500双光束紫外分光光度计(无锡科达仪器厂)

电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)

超声波清洗器(杭州科博仪器有限公司)

恒温水浴装置(金坛市科析仪器有限公司)

离心机

氮气吹干

石英比色皿

1.2.2 试剂

(1)BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚,分析纯)

(2)三氯甲烷(分析纯,浙江杭州双林化工试剂厂)

(3)二氯甲烷(分析纯)

(4)碳酸氢钠(工业级)

(5)氢醌(工业级)

(6)硫代硫酸钠(分析纯)

(7)三氯甲烷处理方法:

分别称取0.1 g碳酸氢钠、硫代硫酸钠、氢醌和BHT置于500mL的棕色容量瓶,加入三氯甲烷至刻度,摇匀超声30 min后过滤待用。

(8)试验溶液:

准确称取虾青素样品40mg(准确至0.0002 g),置于250mL的棕色容量瓶,加入10mg BHT,加入50mL二氯甲烷溶解,在热水浴中超声5min,流水冷却至室温;再加入100 mL三氯甲烷继续超声5min溶解,冷却至室温,然后用三氯甲烷稀释至刻度,摇匀,即为待测溶液。

1.3 实验方法

1.3.1 工作曲线的绘制

精密称取待测虾青素溶液适量,用三氯甲烷溶剂溶解,配置成浓度为1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL、6.0μg/mL的系列标准溶液,用UV8500紫外分光光度计测定不同波长下的吸光度。在最大波长下,以三氯甲烷试剂空白调零,测定吸光度。以虾青素标准溶液的浓度为横坐标,对应吸光度值为纵坐标进行线性回归、绘制标准工作曲线,见图1。得到回归方程式:y=0.1686x+0.075(R2=0.9999)

图1 分光光度法的虾青素标准

1.3.2 实验步骤

准确移取待测溶液A 1.0 mL于50 mL棕色容量瓶中,用处理过的三氯甲烷(三氯甲烷加0.02%氢醌振摇后过滤)稀释至刻度,摇匀,得溶液B。准确移取试验溶液1.0mL于50mL棕色容量瓶中,用处理后的三氯甲烷稀释至刻度,摇匀。

用紫外—可见光分光光度计测定溶液B在波长489 nm处的吸光度(1 cm石英比色皿)。以处理后的三氯甲烷为空白对照。

计算:

式中:

X——样品中虾青素百分含量;

A489——样品溶液在489nm处测得的吸光度;

M——称取样品的质量,g;

12500——样品的稀释倍数;

1975——虾青素的百分吸收系数(E1cm1%)。

误差要求:平衡测定二次,相对偏差不超过1.0%,结果以算术平均值表示。

2 结果与讨论

2.1波长的选择

称取待测虾青素试验溶液适量,用三氯甲烷溶剂稀释成浓度为1μg/mL的标准溶液,在350～600 nm波长范围使用UV8500双光束紫外分光光度计进行光谱扫描,得到吸收光谱图见图2。由图2可知,虾青素在489 nm处有最大吸收。由此分光光度法检测波长选择489 nm。

图2 虾青素标准溶液的吸收光谱图(三氯甲烷)

2.2 精密度试验

精密称取待测虾青素试验溶液1.0mL于50mL棕色容量瓶中,用经处理的三氯甲烷稀释至刻度,摇匀。取待测溶液放入1 cm光径比色皿中,用UV8500紫外分光光度计测定虾青素溶液在489 nm波长处的吸光度值,连续测定6次,计算相对标准偏差RSD=0.36%。

表1 精密度试验结果

2.3 稳定性试验

本实验对虾青素标准样品的稳定性进行了研究。取待测虾青素溶液各两份,一份暴露在自然条件下,另一份充氮密封并避光保存在-18℃的冰箱中。暴露于自然条件下的样品每隔1 h测一次,而冰箱保存的样品每隔1 d测一次。分别按照分光光度法检测吸光度。

试验结果表明,虾青素样品在自然条件下,2 h后样品含量开始有明显的减少,而在冰箱保存条件下3 d后开始出现减少现象。

这是由于虾青素分子中的多烯链导致其具有极大的不稳定性,对光敏感,在光照下易被破坏,很容易被空气中的氧或过氧化物氧化,易受温度、氧化及光照影响而发生降解。如虾青素标准溶液在自然状态下2 h内浓度明显下降。所以对虾青素检测分析样品的最佳保存时间是3 d,并且应避光低温保存,试验操作需要尽快完成且尽可能避光操作,操作过程应尽量减少氧气接触机会,控制操作温度,采用40℃下抽真空旋转蒸发浓缩或氮气吹干,不能空气吹干。样品的超声浴温度不要超过35℃,同时添加2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)作为稳定剂。

2.4 回收率试验

按待测虾青素溶液浓度的75%、100%和125%制备虾青素溶液,各3份,分别测定吸光度。分别加入浓度为100μg/mL虾青素标准溶液1mL、2 mL、3mL用紫外分光光度计测定吸光度值,计算虾青素平均回收率,测得回收率是99.8%～102.5%,结果见表2。

2.5 测定

表3分别是分光光度法和液相色谱法得到的最终虾青素的百分含量,可以看出,分光光度法和液相色谱法检测得到的含量值基本无差异。

表2 回收率测定结果

表3 不同方法得到的虾青素含量

3 结论

本文研究利用虾青素不溶于水,易溶于有机溶剂的特点,将虾青素标准样品经加有0.02%氢醌处理的三氯甲烷提取、稀释12500倍后,在489 nm波长下利用分光光度法对虾青素含量进行测定,其标准曲线的回归方程的r2超过了0.99,线性良好,能用于定量分析测定。分光光度法测定虾青素化学合成品,回收率99.8%～102.5%,相对标准偏差RSD值0.36%;其线性关系好,灵敏度较好,且操作简便、快速、经济,特别适用企业大批量生产虾青素情况下进行测定。

[1]Miki W.Biological functions and activities of animal carotenoids[J].Pure&Appl Chem,1991,63:141-146.

[2]惠伯隶.类胡萝卜素化学及生物化学[M].北京:中国轻工业出版社,2005.

[3]Sedmark J J,Weeradinghe D K,Jolly SO.Extraction and quantitation of astaxanthin from phaffia rhodzyma[J]. Biotechnol tech,1990,4(2):107-112.

[4]Pilar Calo,Jorge B Velazquez,Carmen Sieiro,et al.Analysis of astaxanthin and other carotenoids from several phaffia rhodzymamutants[J].JAgric Food Chem,1995,43:1396-1399.

Analysis of Astaxathin by Spectrophotometry

ZHANG Yong，LIMiao-sha，WU Jia-sheng
(Shangyu NHU Biochemical Co.,Ltd.,Shangyu,Zhejiang 312369,China)

Establish a rapid determination of an analytical assay of astaxathin were desgned from chemical synthesis by spectrophotometry.Using chloroform as extraction solution treated by hydroquinone,under 489nm wavelength determination of absorption.The spectrophotometric method of standard curve regression coefficient is 0.9999.the relative standard deviation is 0.36%,the standard addition recovery is 99.8%～102.5%,show that the analysismethod of high accuracy,good repeatability,and is simple,rapid,and can be used as an enterprise with the determ ination of astaxanthin in mass production.

spectrophotometry;astaxathin;chemical synthesis

1006-4184(2015)9-0051-04

2015-07-15

张泳(1981-),男,浙江绍兴人,在读硕士研究生,主要研究方向:化工分析技术。

*通讯作者:吴嘉圣(1984-),男,工程师,浙江绍兴人,从事精细有机合成研究及相关技术管理工作。E-mail:shengjiawu@163.com。