球孢白僵菌菌丝生长中HsbA基因的表达量变化

张 烨, 雷仲仁, 王海鸿

(中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)



球孢白僵菌菌丝生长中HsbA基因的表达量变化

张 烨, 雷仲仁*, 王海鸿

(中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)

球孢白僵菌是一种具有杀虫潜力的生防真菌,菌丝是其重要的结构单位,而疏水蛋白被认为参与了气生菌丝的生长过程。本文以球孢白僵菌疏水表面结合蛋白编码基因HsbA为检测对象,利用荧光定量PCR方法研究了该基因在液生菌丝和气生菌丝中的相对表达量，结果表明，HsbA基因在气生菌丝中的相对表达量显著高于液生菌丝。基于以上结果,我们推断,HsbA基因在气生环境下的上调表达可能会增加其编码蛋白的总量,从而对球孢白僵菌气生菌丝的生长发育起到调控作用。研究结果不仅为菌种的遗传改良提供了一个切入点,也对菌株的商业化生产有一定的指导意义。

球孢白僵菌;HsbA基因; 菌丝; 气生生长; 荧光定量PCR

球孢白僵菌[Beauveriabassiana(Bals.) Vuill.]是一类广谱性昆虫病原真菌[1-3],已被广泛应用于多种农林害虫的生物防治[4-5]。菌丝体是球孢白僵菌重要的侵染结构和营养结构,它可以通过顶端伸长,以及在近顶端产生分支结构的方式在寄主体表或者营养基质中生长。而疏水蛋白被认为参与了气生菌丝的形成过程[6-7]。

疏水蛋白广泛存在于丝状真菌中,它们的单体结构能通过分子间疏水吸引力在不同物相之间作出反应,因而具有自动组装的能力[8]。基于这一生物学特性,该蛋白也时常被认为是一类具有表面活性的小分子物质,并在菌丝的发育过程中执行了一系列功能。首先,疏水蛋白有助于菌丝突破液-气界面[9-11]。当水面张力达到72 mJ/m2时,会阻碍气生菌丝的发育,但疏水蛋白可以通过形成膜状结构降低液体表面张力,从而有助于菌丝的气生生长;其次,当气生菌丝形成后,疏水蛋白能够在其表面形成短杆状结构层,既赋予了气生菌丝疏水特性,又保证了其他气生结构不至于丧失水分[12]。此外,疏水蛋白还可以通过自身的表达来调节菌丝进行气生生长的时期。当在营养液或者营养基质中培养时,水压会抑制疏水蛋白基因的表达,使得菌丝以基内生长为主,作为气生生长所需养料和水分的一个运输通道[6]。

目前,国内外常选用液固双相法来培养丝状真菌,并以此获得具有侵染能力的气生分生孢子[13]。而在丝状真菌的整个生活史中,基内菌丝的形成以及气生菌丝的发育至关重要,它直接影响着孢子丝的分化及孢子的产生。前人的研究肯定了疏水蛋白在菌丝生长中所起的积极作用,但对于该类蛋白的分子表达机制尚不明确。因此,本文借助荧光定量PCR方法,研究了球孢白僵菌疏水表面结合蛋白(hydrophobic surface binding protein)编码基因HsbA在基内菌丝和气生菌丝中的相对表达量,从转录水平阐述该蛋白编码基因的表达模式,以期为揭示该蛋白在菌丝生长中所行使的功能提供一些佐证,并为菌株的遗传改良提供一些理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器

RNA快速提取试剂盒购自Aidlab公司;DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自Axygen公司;Transcription Reverse System试剂盒购自Promega公司;SYBR Premix ExTaq试剂盒购自TaKaRa公司;其他常规化学试剂由植物病虫害国家重点试验室提供。PCR仪购自Biometra公司;荧光定量PCR iCycler IQ购自Bio-Rad公司;DYY-6C型电泳仪和DYCP-31DN型电泳槽购自北京六一厂;Biodoc-It 220型凝胶成像系统购自美国UVP公司。

1.1.2 菌株和载体

球孢白僵菌强毒株SZ-26由本实验室从田间感病寄主上分离并筛选后保存,大肠杆菌DH5α菌株和克隆载体pBM19-T均购自Biomed公司。

1.1.3 培养基

Czapek培养基(固体培养基需另加入15 g琼脂)：NaNO33 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO40.5 g,FeSO40.01 g,蔗糖30 g,加蒸馏水定容到1 L,灭菌。

1.2 培养方法

1.2.1 液体培养

将球孢白僵菌菌株SZ-26的分生孢子均匀分散于0.05% Tween-80溶液中,并等量接种到Czapek培养液中,于26 ℃、120 r/min下振荡培养,分别于3、5、7和9 d取样。培养物以真空抽滤,获得液培菌丝,液氮中冻存备用。

1.2.2 固体培养

将球孢白僵菌菌株SZ-26的分生孢子均匀分散于0.05% Tween-80溶液中,等量接种到Czapek平板并用涂布器使其分布均匀,于26 ℃下静置培养,分别于3、5、7和9 d取样。收集气生菌丝,液氮中冻存备用。

1.3 分析方法

1.3.1 总RNA的提取及cDNA第一链的合成

将各处理样本于液氮中充分研磨成细粉状,参照RNA快速提取试剂盒说明书进行球孢白僵菌总RNA的提取,电泳检测。利用DNaseⅠ除去DNA并测定消化后RNA样本的浓度及纯度,利用反转录试剂盒合成cDNA第一链。

1.3.2 荧光定量PCR分析HsbA基因的相对表达量

质粒标样的构建：利用ExTaq聚合酶对反转录模板进行PCR反应,根据已获得的HsbA基因全长设计目的基因引物[14],并参照Cho等所选择的内参基因进行荧光引物合成[15]。目的基因HsbA正向引物：5′-CTCGTCGGTCCGTCCAAC-3′,反向引物：5′-GGCGTCAGTCACTCCCGT-3′;内参基因β-tubulin正向引物：5′-TCCTTCGTACGGTGACCTGA-3′,反向引物：5′-CGAGCTTGCGAAGATCAGAG-3′。扩增条件如下：95 ℃,1 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃,5 min。分别将目的基因和内参基因扩增产物进行电泳回收,并克隆到载体pBM19-T中进行测序。回收测序正确的单克隆质粒作为质粒标样,对其进行浓度和纯度测定。

qRT-PCR反应：将质粒标样做连续10倍稀释,得到6个浓度梯度用于标准曲线的绘制。同一反应板包括质粒标样(内参或者目的基因)及对应的处理样本。反应条件如下：95 ℃,3 min;95 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,80个循环,每循环退火温度增加0.5 ℃。

相对表达量的计算:用标准曲线相对定量法分析目的基因的相对表达量，所用方法同Pfaffl[16]。试验结果用归一化值表示，HsbA基因表达量归一化值=HsbA基因浓度/β-tubulin基因浓度。以液生菌丝HsbA基因在第3天时的表达量为基准，利用公式：HsbA基因相对表达量=待测样品HsbA基因表达量归一化值/液生菌丝HsbA基因在第3天时的表达量归一化值，计算待测样品HsbA基因的相对表达量值，其中，液生菌丝HsbA基因在第3天时的相对表达量值即为1。

1.3.3 数据分析

每个样本设置3次生物学重复,每个生物学重复包含3次技术重复,每个反应板设置相应的空白对照。所有的数据经预处理后,由数据统计软件SPSS V16.0进行单因素方差分析,显著性水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

利用荧光实时定量PCR法分别测定球孢白僵菌内参基因β-tubulin和目的基因HsbA不同浓度下的Ct值,并绘制标准曲线,得到线性方程y=-3.218x+41.697(R2>0.99)和y=-3.237x+40.035(R2>0.99),且β-tubulin和HsbA基因的扩增效率E分别为104.7%和103.7%(图1～2)。

图1 球孢白僵菌内参基因β-tubulin标准曲线Fig.1 Standard curve of β-tubulin gene in Beauveria bassiana

图2 球孢白僵菌目的基因HsbA标准曲线Fig.2 Standard curve of HsbA gene in Beauveria bassiana

2.2 HsbA基因在菌丝生长中的相对表达量分析

将同一培养时间下液生菌丝和气生菌丝中HsbA基因的相对表达量进行t-检验,统计结果表明,在3、5、7和9 d时,HsbA基因在气生菌丝中的相对表达量均显著高于液生菌丝(t=-5.56,df=4,P<0.01;t=-28.771,df=4,P<0.01;t=-12.486,df=4,P<0.01;t=-6.758,df=4,P<0.01),且在第7天时,该基因的相对表达量达到最大(图3)。

图3 HsbA基因在不同培养时间下的相对表达量 Fig.3 Relative abundance of HsbA under different incubation times

3 讨论

内参基因的选择、引物的设计和反应体系的优化是影响荧光定量PCR反应的几个关键性因素。本试验选择的β-tubulin基因为常见的内参基因[17],其在不同菌丝类型中均能稳定表达。此外,基于阈值循环数和起始模板浓度对数所绘制的标准曲线具有较高的拟合度,且目的基因和内参基因的扩增效率理想。因此,本试验所选用的引物和反应条件适于荧光定量PCR反应,结果具有一定的可信度。

对气生菌丝和液生菌丝不同时期HsbA基因的相对表达量进行分析,结果表明,气生菌丝中该基因的相对表达量在同一时期均显著高于液生菌丝。这主要是因为,相对于液生菌丝,气生菌丝的生长发育需要克服一系列的生存障碍[18]。首先,培养基质和空气之间的表面张力会阻碍菌丝的气生生长;其次,菌丝在空气中会遭受到干燥缺水的威胁[19-20]。因此,当气生菌丝生长时,会通过HsbA基因的上调表达产生抵抗逆境的蛋白产物,从而起到保护作用。该结论已经在裂褶菌[Schizophyllumcommune(Fr.)]中的SC3蛋白和SC4蛋白[7]、双孢蘑菇[Agaricusbisporus(Lang.)]中的ABH3蛋白[11]、榆枯萎病菌[Ophiostomaulmi(Buisman)和O.novo-ulmi(Brasier)]中的CU蛋白[21-22]、唐德链霉菌(Streptomycestendae)的表面活性蛋白streptofactin[23]、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)中的短肽类物质SapB[24]中得到证实,一些其他的疏水类蛋白也表现出类似的功能[25-26]。据此可推断,在球孢白僵菌气生菌丝的生长发育过程中,HsbA基因可能通过自身的上调表达来增加其编码蛋白总量,从而对该过程起到一定的调控作用。

随着球孢白僵菌制剂的产业化推进,人们愈发关注菌种在批量生产中的得率,并采取了一系列优化措施。传统的优化手段集中在培养条件的控制上,通常只是通过改变生长环境被动地去迎合菌体的生长,而对与菌种生长发育相关功能基因的研究则可以让我们适度改造菌株,使其具有新的优良性状,去主动适应环境。本研究发现了HsbA基因在球孢白僵菌气生菌丝生长发育中的积极作用,这不仅为菌株的生长发育研究提供了理论基础,也为工程菌株的改造提供了一些切入点,使我们可以从分子水平“趋利避害”,使菌种的生产效率最大化,对菌种的规模生产具有重要的现实意义。

[1] St Leger R J, Screen S.Prospects for strain improvement of fungal pathogens of insects and weeds [M]∥Butt T M, Jackson C, Morgan N, eds. Fungal biocontrol agents: Progress, problems and potential. London: CABI International,2001: 219-237.

[2] Baker R, Bextun E, Harlan G, et al. Field application of bait-formulatedBeauveriabassianaalginate pellets for biological control of the red imported fire ant[J].Biological Control, 2002, 31(4):746-752.

[3] Tafoya F, Zuniga-Delgadillo M, Alatorre R. Pathogenicity ofBeauveriabassiana(Deuteromycota:Hyphomycetes) against the cactus weevil,Metamasiusspinolae(Coleoptera： Curculionidae) under laboratory conditions[J].Florida Entomologist, 2004, 87(4):533-536.

[4] 李春香,张淑红. 白僵菌对害虫致病性的研究进展[J].唐山师范学院学报,2005,27(5)：40-43.

[5] 刘健,陈洪章,李佐虎. 白僵菌杀虫剂生产工艺研究状况与展望[J].中国生物防治,2003,19(2)：86-90.

[6] Wessels J G H.Hydrophobins, proteins that change the nature of the fungal surface[J].Advances in Microbial Physiology,1997, 38: 1-45.

[7] Wösten H A B, van Wetter M A, Lugones L G, et al. How a fungus escapes the water to grow into the air [J].Current Biology,1999, 9(2): 85-88.

[8] 林福呈. 真菌疏水蛋白的研究进展[J].微生物学报,2001,41(4)：518-521.

[9] de Vries O M H, Moore S, Arntz C, et al. Identification and characterization of a tri-partite hydrophobin fromClavicepsfusiformis. A novel type of class II hydrophobin [J].European Journal of Biochemistry,1999, 262(2): 377-385.

[10]Lugones L G, Wösten H A B, Birkenkamp K U, et al. Hydrophobin line air channels in fruiting bodies ofSchizophyllumCommuneandAgaricusbisporus[J].Mycological Research,1999, 103(5): 635-640.

[11]Lugones L G, Wösten H A B, Wessels J G H.A hydrophobin (ABH3) specifically secreted by vegetatively growing hyphae ofAgaricusbisporus(common white button mushroom)[J].Microbiology,1998,144: 2345-2353.

[12]van der Vegt W, van der Mei H C, Wösten H A B, et al. A comparison of the surface activity of the fungal hydrophobin SC3p with those of other proteins [J]. Biophysical Chemistry,1996, 57: 253-260.

[13]Feng Mingguang, Poprawski T J, Khachatourians G G.Production of formulation and application of the entomopathogenic fungusBeauveriabassianafor insect control: current status [J].Biocontrol Science and Technology,1994, 4(1): 3-34.

[14]张烨，雷仲仁，王海鸿，等.球孢白僵菌HsbA蛋白的原核表达及免疫定位[J].中国农业科学，2013,46(21)：4534-4541.

[15]Cho E M, Kirkland B H, Holder D J, et al. Phage display cDNA cloning and expression analysis of hydrophobins from the entomopathogenic fungusBeauveria(Cordyceps)bassiana[J].Microbiology, 2007,153(10): 3438-3447.

[16]Pfaffl M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR [J].Nucleic Acids Research，2001,29(9)：2002-2007.

[17]Radonic A, Thulke S, Mackay I M, et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR [J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2004,313:856-862.

[18]Wösten H A B.Hydrophobins: multipurpose proteins [J].Annual Review of Microbiology, 2001, 55: 625-646.

[19]Beever R E, Dempsey G P.Function of rodlets on the surface of fungal spores [J].Nature, 1978, 272: 608-610.

[20]Wösten H A B, de Vries O M H, Wessels J G H.Interfacial self-assembly of a fungal hydrophobin into a rodlet layer [J].Plant Cell, 1993,5: 1567-1574.

[21]Bowden C G, Smalley E, Guries R P, et al. Lack of association between cerato-ulmin production and virulence inOphiostomanovo-ulmi[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,1996,9(7):556-564.

[22]Temple B, Horgen P A, Bernier L, et al. Cerato-ulmin, a hydrophobin secreted by the causal agents of Dutch elm disease, is a parasitic fitness factor [J].Fungal Genetics and Biology,1997,22(1):39-53.

[23]Richter M, Willey J M, Süssmuth R, et al. Streptofactin, a novel biosurfactant with aerial mycelium inducing activity fromStreptomycestendaeTü901/8c [J].FEMS Microbiology Letters, 1998,163(2): 165-172.

[24]Tillotson R D, Wösten H A B, Richter M, et al. A surface active protein involved in aerial hyphae formation in the filamentous fungusSchizophillumcommunerestores the capacity of a bald mutant of the filamentous bacteriumStreptomycescoelicolorto erect aerial structures[J].Molecular Microbiology,1998, 30(3): 595-602.

[26]Wösten H A B, de Vocht M L.Hydrophobin, the fungal coat unravelled [J].Biochimica et Biophysica Acta, 2000,1469: 79-86.

(责任编辑：杨明丽)

Dynamics ofBeauveriabassianaHsbAgene expression levels in hyphal growth

Zhang Ye, Lei Zhongren, Wang Haihong

(State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100193, China)

Beauveriabassianais an important entomogenous fungus which has the potential for pest control. Mycelia are the major structural unit ofB.bassiana, and hydrophobins are considered to participate in the process of aerial hyphae. In the present study, relative expression abundance ofB.bassianaHsbA(hydrophobic surface binding protein) gene in aerial hyphae and substrate mycelia were analyzed by using qRT-PCR.The results showed that the expression level ofHsbAgene in aerial hyphae was significantly higher than that in substrate mycelia. Based on the above results, we concluded that up-regulated expression ofHsbAgene might increase the amount of protein encoded, which could regulate the development of aerial hyphae inB.bassiana. This conclusion provided not only an approach to strain improvement, but also a guide for commercial production of this fungus.

Beauveriabassiana;HsbAgene; hypha; growth in the air; qRT-PCR

2014-06-08

2014-07-09

国家现代农业科技城产业培育项目(Z121100001212006)；现代农业产业技术体系(CARS-25-B-07)

Q 965

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.025

* 通信作者 E-mail: leizhr@sina.com