雷帕霉素洗脱支架损伤血管内皮的作用机制探讨

袁玲，聂卫，高萍，陈斌，刘伟伟，崔晓雪

雷帕霉素洗脱支架损伤血管内皮的作用机制探讨

袁玲，聂卫，高萍，陈斌，刘伟伟，崔晓雪

目的探讨雷帕霉素洗脱支架损伤血管内皮的作用机制。方法（1）对兔行局部肌肉注射雷帕霉素（雷帕霉素组），模拟雷帕霉素洗脱支架安全性评价中的肌肉植入，同时设正常对照组和丙酮对照组。观察各组形态变化及测定匀浆液钙含量。（2）采用雷帕霉素0.1、1、10及100 μg/L处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）48 h及1 μg/L雷帕霉素处理HUVEC 6、12、24及48 h，采用MTT法检测细胞存活率，分析细胞存活率与药物浓度及处理时间的关系。（3）HUVEC分设正常对照组、1 μg/L雷帕霉素组。48 h后HE染色观察细胞形态变化，用NO检测试剂盒测定细胞培养液NO含量，采用Fluo-3/AM荧光探针标记细胞内Ca2+。结果（1）雷帕霉素组出现支架植入类似的蓝染表现，雷帕霉素组较正常对照组和丙酮对照组钙含量升高（P＜0.05）。（2）雷帕霉素处理HUVEC后，细胞存活率随浓度增加和时间延长均呈逐渐降低趋势（P＜0.01）。（3）雷帕霉素组细胞胞浆出现空泡、核固缩及核碎裂，与正常对照组比较，细胞培养液NO含量降低，细胞内游离Ca2+含量增高（P＜0.05）。结论雷帕霉素洗脱支架中抗增殖药雷帕霉素对血管内皮有损伤作用，其机制可能与引起细胞内钙升高有关。

西罗莫司；内皮，血管；药物洗脱支架；脐静脉；钙；疾病模型，动物

冠状动脉内支架置入术已成为治疗冠心病的重要手段之一。雷帕霉素洗脱支架因能抑制细胞增生、发挥抗狭窄作用而得到了较快发展，但其易造成内皮化延迟，进而增加血栓形成的风险。血管内皮的完整性和功能健全是防止血小板聚集和血栓形成的关键。目前有关雷帕霉素洗脱支架引起内皮化延迟的因素争议较多，包括支架聚合物涂层刺激［1］、支架引起的局部炎症［2］和抗增殖药物雷帕霉素局部释

放［3］等。本研究采用抗增殖药雷帕霉素对兔行局部肌肉注射，模拟该支架安全评价（安评）实验中肌肉植入实验并作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC），旨在探讨雷帕霉素是否可引起内皮损伤及其可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料普通级日本大耳白兔18只，雌性，平均体质量（2.0±0.2）kg，购自北京科宇动物养殖中心，合格证号：11400800000295。HUVEC及其完全培养液（HUVEC-004）购自美国ALLCELLS公司；0.25%胰酶购自gibco公司；雷帕霉素购自华北制药集团公司；四噻唑蓝（MTT）购自美国Amresco公司；钙离子荧光探针Fluo-3 AM、嵌段式聚醚F-127（Pluronic 127）购自美国Biotium公司；NO测定试剂盒购自南京建成生物工程所。

1.2 模型制作及分组日本大耳白兔18只，随机数字表法均分为3组。雷帕霉素组：模拟雷帕霉素洗脱支架安全性评价的肌肉植入实验，于兔背部剪毛备皮后，以戊巴比妥钠耳缘静脉注射35 mg/kg麻醉，经背部正中切开皮肤，于脊柱左右侧分别注射3处雷帕霉素溶液0.1 mL，间隔1.5 cm，浓度为2 000 mg/L（支架载药量一般为100～200µg），距离注射处1.5 cm缝线标记。正常对照组和丙酮对照组以同样的方法分别注射0.1 mL生理盐水和纯丙酮。各组分别于3、7 d处死3只，每只取左侧3块注射部位肌肉组织固定于10%中性福尔马林中，进行组织病理制片，行HE染色后观察，并与安评实验中雷帕霉素洗脱支架肌肉植入7 d的组织切片进行比对；右侧3块局部肌肉组织匀浆后于全自动生化分析仪测匀浆液钙含量。本研究对动物的处理方法符合动物伦理学要求。

1.3 HUVEC培养及MTT检测细胞存活率将HUVEC培养于完全培养液，置于37℃、5%体积分数CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养，细胞贴壁并生长至80%以上融合时，用0.25%胰酶消化传代。将对数生长期的HUVEC用0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，将细胞按5 000个/孔密度接种于96孔板，分为：（1）正常对照组，磷酸盐缓冲液刺激。（2）雷帕霉素组，分别给予雷帕霉素0.1、1、10及100 μg/L处理48 h，以及参照文献［4］雷帕霉素1 μg/L处理6、12、24及48 h。各组均按常规MTT法于相应处理后检测细胞存活率。每组设置6个复孔，实验重复3次。

1.4 HE染色观察HUVEC损伤形态的变化将HUVEC接种于6孔板，分为正常对照组、雷帕霉素组。待细胞贴壁后，雷帕霉素组给予含1 μg/L雷帕霉素的培养基培养细胞，正常对照组给予同体积的完全培养基培养细胞，处理48 h后，PBS洗涤细胞2次，95%乙醇固定10 min，HE染色，倒置显微镜观察并采图。

1.5 HUVEC培养液NO含量检测将HUVEC接种于6孔板，分组处理同1.4，处理48 h后，收集2组细胞培养液，按试剂盒说明处理，用721型可见光分光光度仪测定550 nm的吸光度（A）值。根据所得的A值，计算NO的浓度=（测定管A值-空白管A值）/（标准管A值-空白管A值）×标准管浓度×样品测试前的稀释倍数。

1.6 流式细胞仪检测胞质Ca2+浓度将HUVEC接种于6孔板，分组同1.4，处理48 h后，消化细胞制成单细胞悬液，按每100 μL细胞悬液加入1 μL Fluo-3/AM的比例，使溶液终浓度为4.4 μmol/L，37℃孵育30 min，PBS洗涤3次后，室温孵育20 min，流式细胞仪（美国BD公司）上用FLl通道检测荧光强度（激发波长为488 nm，发射波长为520 nm），重复测量3次，并使用FCS Express 4.0软件分析10 000个细胞的平均荧光强度。

1.7 统计学方法采用SPSS 17.0进行统计学处理。符合正态分布的计量数据以表示，2组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验。相关性分析采用Spearman法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 局部肌肉组织变化及匀浆液钙含量安评中肌肉植入最短时间点为7 d，因而本组缺乏3 d安评HE染色结果。7 d时，正常对照组可见肌肉组织形态正常；丙酮对照组可见坏死肌肉呈均质红染；雷帕霉素组可见坏死肌肉呈蓝染表现，安评实验中雷帕霉素洗脱支架肌肉植入组可见坏死肌肉呈蓝染表现，见图1。雷帕霉素组较正常对照组和丙酮对照组钙含量升高（P＜0.05），2对照组差异无统计学意义，见表1。

Fig.1Effect of rapamycin on local morphological changes upon intramuscular injection（HE，×100）图1 不同处理后各组细胞组织形态改变（HE，×100）

2.2 HUVEC存活率正常对照组细胞存活率为100%，雷帕霉素0.1、1、10及100 μg/L处理HUVEC 48 h后，细胞的存活率分别降低为（81.2±2.5）%、

（67.3±3.2）%、（57.5±4.4）%、（50.3±3.8）%（F= 117.006，P＜0.01），HUVEC存活率减少呈浓度依赖性（rs=-0.639，P＜0.05）。与正常对照组比较，1 μg/L雷帕霉素处理HUVEC 6、12、24及48 h后，细胞的存活率分别降低为（94.1±1.9）%、（89.2±2.3）%、（81.6±3.5）%及（69.8±3.2）%（F=62.101，P＜0.01）。

2.3 HUVEC形态正常对照组可见细胞呈椭圆形、多角形、短梭形、单层铺路石样排列，边界清，胞浆丰富，胞核呈圆形或椭圆形，偶见双核，见图2A；雷帕霉素组可见细胞肿胀，胞浆出现空泡，部分细胞核固缩、核碎裂，有些坏死固缩细胞在染色过程中脱落，见图2B。

Tab.1Comparison of calcium content in cell homogenate between all three groups表1 各组匀浆液钙含量结果比较（n=3，mmol/L，）

Tab.1Comparison of calcium content in cell homogenate between all three groups表1 各组匀浆液钙含量结果比较（n=3，mmol/L，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与正常对照组比较，b与丙酮对照组比较，均P＜0.05

组别正常对照组丙酮对照组雷帕霉素组F 3 d 1 . 2 0 ± 0 . 0 5 1 . 3 0 ± 0 . 1 2 8 . 7 8 ± 1 . 2 0ab1 1 6 . 8 4 1＊＊7 d 1 . 2 0 ± 0 . 0 4 1 . 4 0 ± 0 . 1 0 1 3 . 5 0 ± 2 . 3 0ab8 1 . 2 7 2＊

Fig.2Effect of rapamycin on cell morphology of HUVEC图2 雷帕霉素处理对HUVEC形态的影响（HE，×100）

2.4 HUVEC的NO变化情况雷帕霉素组NO含量低于正常对照组［（26.4±1.7）μmol/L vs（61.9±4.6）μmol/L，t=12.599，P＜0.01］。

2.5 HUVEC Ca2+含量变化雷帕霉素组细胞内Ca2+水平高于正常对照组［（5 055±243）F1 vs（1 384± 45）F1，t=25.637，P＜0.01］，见图3。

Fig.3Effect of rapamycin on intracellular-free Ca2+levels of HUVEC图3 雷帕霉素处理对HUVEC Ca2+含量的影响

3 讨论

雷帕霉素洗脱支架通过抑制平滑肌细胞增殖以预防再狭窄的发生，但其在抑制平滑肌细胞增生的同时，也抑制了损伤动脉的愈合及内皮化，因而可能导致局部延迟愈合，增加了迟发性血栓形成的风险，对药物涂层支架的长期疗效产生不利影响。尽管患者在植入雷帕霉素洗脱支架后长期应用抗血小板聚集治疗，但相对裸支架，经药物洗脱支架治疗的患者中晚期不良事件的发生亦更多见，支架内血栓虽然罕见但危害极大，常常会导致心肌梗死和猝死［5］。

目前，对于雷帕霉素洗脱支架引起内皮化延迟的因素争议较多。有学者认为这可能与支架聚合物涂层局部刺激有关，相关研究多致力于开发更多的生物可降解聚合物支架、可吸收支架及无聚合物载体药物支架等［6］。但随后有研究显示，无药物覆载的可降解镁合金支架（AMS-1），45%的管腔回缩归因于支架置入6个月时的血管内膜过度增生，覆载增殖药物的洗脱释放是必不可少的［7］。也有学者认为，雷帕霉素洗脱支架引起内皮化延迟和支架引起的局部炎症有关，认为局部炎症抑制内皮修复，导致血小板激活和黏附、聚集，从而增加了迟发性血栓形成的风险［2］。目前较多的研究认为，其和抗增殖药物雷帕霉素局部缓慢释放有关［3，8］。因此，当前对于雷帕霉素洗脱支架植入后有关内皮化延迟及其发生机制的认识还不够明晰。

本研究显示，该支架对家兔肌肉植入组织有特异的组织坏死表现，不同于一般肌肉坏死均质粉染的表现，其呈现蓝染表现，在对兔行雷帕霉素注射后，局部肌肉组织HE染色观察结果显示，其能出现与其支架植入后一致的病理表现，提示可能是雷帕霉素药物而不是涂层聚合物抑制了损伤动脉的愈合及内皮化。Holy等［3］亦认为抗增殖药雷帕霉素可造成内皮化延迟。

雷帕霉素是一种大环内酯类抗生素，亦有免疫抑制作用，能抑制细胞的增殖。作为药物涂层支架的主要应用药物之一，雷帕霉素在局部冠状动脉缓慢释放，可能会对局部冠脉内皮包括损伤处及周围产生毒性。本研究显示，雷帕霉素处理HUVEC后，细胞存活率随浓度增加和时间延长均呈逐渐降低趋势，HE染色观察细胞形态变化明显，雷帕霉素组NO含量低于正常对照组，表明随作用浓度增加及作用时间延长，雷帕霉素降低内皮细胞存活率、减少NO分泌量的能力亦增强，证实了其能抑制血管内皮增殖并损害其功能，此与Jin等［9］研究相近。

另外，本研究显示，雷帕霉素组细胞内Ca2+含量

高于正常对照组，表明雷帕霉素明显增加了局部组织钙含量。为鉴定雷帕霉素引起的钙增高来源于组织间隙还是细胞内，本实验采用FLUO-3AM荧光探针标记细胞内Ca2+，流式细胞仪检测细胞内荧光强度改变情况，结果显示，与正常对照组比较，雷帕霉素能增加内皮细胞内钙含量，提示雷帕霉素引起的内皮细胞损害可能与其造成的细胞内钙超载有关。

综上所述，雷帕霉素作为药物涂层支架的主要药物之一，可能是支架区内皮覆盖延迟，继而引起血栓形成的主要因素。雷帕霉素抑制内皮细胞增殖并损害其功能，从而造成内皮化延迟的机制可能与雷帕霉素引起的内皮细胞内钙超载有关。

［1］Ma Q，Zhou YJ.Current situation research of sirolimus-eluting stent related stent thrombosis［J］.Journal of Cardiovascular＆Pulmonary Diseases，2012，31（6）:752-754.［马茜，周玉杰.雷帕霉素洗脱支架相关的支架血栓现状研究［J］.心肺血管病杂志，2012，31（6）:752-754］.

［2］Inoue T，Croce K，Morooka T，et al.Vascular inflammation and repair:implications for reendothelialization，restenosis，and stent thrombosis［J］.JACC Cardiovasc Interv，2011，4（10）:1057-1066. doi:10.1016/j.jcin.2011.05.025.

［3］Holy EW，Jakob P，Eickner T，et al.PI3K/p110α inhibition selectively interferes with arterial thrombosis and neointima formation，but not reendothelialization:potential implications for drug-eluting stent design［J］.Eur Heart J，2014，35（12）:808-820.doi:10.1093/eurheartj/eht496.

［4］Zhang P，Qiao K，Ren YS，et al.Protective effect of silymarin against rapamycin-induced apoptosis and proliferation inhibition in endothelial progenitor cells［J］.Chin Heart J，2013，25（4）:393-399.［张鹏，乔昆，任雨笙，等.水飞蓟素对雷帕霉素诱导的内皮祖细胞凋亡和生长抑制的拮抗作用［J］.心脏杂志，2013，25（4）：393-399］.doi: 10.13191/j.chj.2013.04.003.

［5］Steg PG，Fox KA，Eagle KA，et al.Mortality following placement of drugeluting and bare-metal stents for ST-segment elevation acute myocardial infarction in the global registry of acute coronary events［J］.Eur Heart J，2009，30（3）:321-329.doi:10.1093/eurheartj/ ehn604.

［6］Itagaki BK，Brar SS.Controversies in the use&implementation of drug-eluting stent technology［J］.Indian J Med Res，2012，136（6）: 926-941.

［7］Erbel R，Di Mario C，Bartunek J，et al.Temporary scaffolding of coronary arteries with bioabsorbable magnesium stents:a prospective，non-randomised multicentre trial［J］.Lancet，2007，369（9576）: 1869-1875．

［8］Qiao Y，Bian Y，Yan X，et al.Efficacy and safety of sirolimus-eluting stents versus bare-metal stents in coronary artery disease patients with diabetes:a meta-analysis［J］.Cardiovasc J Afr，2013，24（7）:274-279.doi:10.5830/CVJA-2013-062.

［9］Jin C，Zhao Y，Yu L，et al.MicroRNA-21 mediates the rapamycininduced suppression of endothelial proliferation and migration［J］.FEBS Lett，2013，587（4）:378-385.doi:10.1016/j.febslet.2012.12.021.

（2015-05-18收稿 2015-08-11修回）

（本文编辑 陆荣展）

The role of rapamycin-eluted stent in vascular endothelial injury

YUAN Ling，NIE Wei，GAO Ping，CHEN Bin，LIU Weiwei，CUI Xiaoxue
Tianjin Institute of Medical Science，Tianjin 300020，China

ObjectiveTo explore the mechanism of rapamycin-eluted stent in vascular endothelial injury.Methods（1）Rapamycin（rapamycin group）was injected to rabbit dorsum muscle to simulate rapamycin-eluted stent implantation into muscles.Control group and acetone control group were established at the same time.Morphological change in muscle was observed and serum calcium levels were measured after rapamycin injection.（2）HUVECs were incubated with 0.1，1，10 and 100 μg/L rapamycin for 48 h respectively or with 1 μg/L rapamycin for 6，12，24 and 48 h respectively．Cell viability was examined by MTT and its relationship with drug concentration and treatment time were analyzed.（3）HUVECs were divided into control group and 1 μg/L rapamycin group.After 48 h，morphological changes of HUVECs were assessed by HE staining，the production of nitric oxide was examined by Nitric Oxide Assay Kit and the intracellular calcium ion concentration was tagged with Fluo-3/AM.Results（1）Organizational morphology in local muscle with rapamycin injection represent stent implantation of rabbit，and calcium content in local muscle increased significantly in rapamycin group compared with nomal control group and acetone control group（P＜0.05）.（2）Cell survival rate decreased significantly upon administration of rapamycin in both concentration and time dependent manner（P＜0.01）.（3）In rapamycin group，cytoplasm vacuoles，nucleus pycnosis and nuclear fragmentation were observed；compared with control group，the levels of intracellular free Ca2+increased while the levels of nitric oxide was reduced.ConclusionRapamycin treatment lead of injury to vascular endothelial cells which might through up-regulating intracellular Ca2+level.

Sirolimus；endothelium，vascular；drug-eluting stents；umbilical veins；calcium；disease models，animal

R543.3，R965.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.015

天津市卫生局科技基金项目（2013KY37）

天津市医药科学研究所（邮编300020）

袁玲（1979），女，助理研究员，硕士，主要从事药物毒理、病理，医疗器械安全性评价方面研究