复方甘草酸苷对HaCaT细胞表达IL-2、IL-4的影响

2015-11-24尹翠红车雅敏

天津医药 2015年12期

尹翠红，车雅敏

尹翠红，车雅敏△

目的观察复方甘草酸苷（CG）对角质形成细胞株HaCaT细胞增殖的抑制作用及其表达白细胞介素（IL）-2、IL-4的影响，探讨CG治疗银屑病的作用机制。方法将培养的HaCaT细胞分为4组：空白对照组（不加CG）；低浓度组（1 mL细胞培养液中加入50 μL CG）；中浓度组（1 mL细胞培养液中加入100 μL CG）；高浓度组（1 mL细胞培养液中加入200 μL CG）。采用噻唑蓝（MTT）方法检测24 h后不同浓度CG对HaCaT细胞增殖的抑制作用；双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）分析不同浓度CG处理后的HaCaT细胞上清液中IL-2及IL-4的表达水平。结果低、中、高浓度CG干预HaCaT细胞24 h后均可见到明显的增殖抑制作用。不同浓度CG干预HaCaT细胞24 h后，低浓度组上清液中IL-2的浓度与空白对照组无明显差异（ng/L：234.51±17.98 vs 225.31±16.23，P＞0.05）；中、高浓度组的IL-2浓度明显低于空白对照组及低浓度组，且高浓度组低于中浓度组（ng/L：188.99±19.22 vs 208.49±18.40，P＜0.05）；高浓度组培养上清液中IL-4的浓度较其余3组明显升高（ng/L：45.67±10.29 vs 37.62±3.90、39.68±6.08、43.85± 10.26，P＜0.05）。结论CG可能是通过调节细胞因子IL-2与IL-4的分泌而抑制皮肤角质形成细胞的增殖。

复方甘草酸苷；HaCaT细胞；白细胞介素-2；白细胞介素-4；细胞增殖

复方甘草酸苷（compound glycyrrhizin，CG）因具有抗炎、抗变态反应、调节免疫、抑制病毒增殖等作用，临床上一直被广泛应用于病毒性肝炎、肝硬化等疾病的治疗，其疗效已被公认［1］。近十几年来，临床有报道用CG治疗T细胞相关性炎症性皮肤病，如银屑病、斑秃、扁平苔藓等，效果较好［2］，进一步研究发

现CG可降低T细胞群的活性，帮助恢复淋巴细胞功能［3］。现已证实，T细胞异常活化是导致银屑病发生的重要因素，在银屑病皮损和外周血中，Th1细胞因子白细胞介素（IL）-2、肿瘤坏死因子（TNF）-α高表达而Th2细胞因子IL-4、IL-10低表达［4-5］，包括T淋巴细胞、树突细胞和不同的免疫相关细胞因子的活化形成复杂的细胞因子网络，促进角质形成细胞的过度增殖。近年研究发现CG可能通过调节IL-8、转化生长因子（TGF）-β等细胞因子的分泌来达到治疗银屑病的目的［6］。但是，关于CG对Th1、Th2主要细胞因子IL-2、IL-4的作用情况尚不清楚。本研究采用不同浓度CG体外干预HaCaT细胞，通过检测HaCaT细胞增殖变化及培养上清液中IL-2、IL-4的变化，以期为CG治疗银屑病等免疫性疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器DMEM培养基购自北京赛默飞生物有限公司；PBS、胰酶-EDTA消化酶、胎牛血清、二甲基亚砜（DMSO）均购自北京索莱宝公司；噻唑蓝（MTT）购自美国sigma公司；IL-2、IL-4酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自上海慧颖生物科技有限公司。CG注射液是由甘草甜素、甘氨酸及盐酸半胱氨酸组成的复方制剂（商品名：美能，SNMC），购自日本米诺发源制药株氏会社，每2 mL复方制剂中分别含甘草甜素、甘氨酸及盐酸半胱氨酸分别为4、40及2 mg；人永生角质形成细胞HaCaT细胞株由我科实验室保存；Synergy MX型酶标仪（美国Bio Tek公司）。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测不同浓度CG对HaCaT细胞增殖活性的影响HaCaT细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的DMEM培养液于37℃、5%CO2饱和湿度下贴壁培养。待细胞达到80%融合时进行传代，传代时去除培养液，使用PBS润洗细胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化后，将对数生长期的单细胞悬液以1×104个/mL的密度接种在96孔板上，200 μL/孔，次日细胞贴壁后换培养液培养24 h，分为空白对照组、低浓度组、中浓度组与高浓度组，后3组分别加入不同浓度CG（甘草酸苷体积比分别为0.05、0.1、0.2），继续培养24 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，37℃孵育4 h，弃上清，每孔加150 μL DMSO，于摇床上轻微振荡10 min，酶联免疫仪测定各孔在波长490 nm处光密度（OD）值。

1.2.2 ELISA法检测不同浓度CG作用HaCaT细胞上清液中IL-2、IL-4的分泌水平取对数生长期的细胞接种于96孔板，加入不同浓度的CG，培养24 h后，收集上清液，离心，采用双抗夹心ELISA法检测上清液中IL-2、IL-4水平，严格按照试剂盒操作说明进行，建立标准曲线，酶标仪测定450 nm处OD值，根据标准曲线读取样品浓度。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件对所得数据进行统计学处理，结果以表示，多组比较用F检验，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度CG对HaCaT细胞增殖活性的影响低、中、高浓度CG对HaCaT细胞增殖能力的抑制作用均较空白对照组明显增强（P＜0.05），见表1。

Tab.1Comparison of proliferation and relative contents of IL-2，IL-4 in HaCaT cells between four groups表1 各组HaCaT细胞增殖活性及IL-2、IL-4相对含量比较（n=10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与空白对照组比较，b与低浓度组比较，c与中浓度组比较，P＜0.05

组别空白对照组低浓度组中浓度组高浓度组F O D值0 . 5 0 ± 0 . 0 2 0 . 4 8 ± 0 . 0 2 a 0 . 4 7 ± 0 . 0 3 a 0 . 4 5 ± 0 . 0 3 a 7 . 8 2＊＊I L -2（n g / L）2 3 4 . 5 1 ± 1 7 . 9 8 2 2 5 . 3 1 ± 1 6 . 2 3 2 0 8 . 4 9 ± 1 8 . 4 0 a b 1 8 8 . 9 9 ± 1 9 . 2 2 a b c 1 2 . 4 0＊＊I L -4（n g / L）3 7 . 6 2 ± 3 . 9 0 3 9 . 6 8 ± 6 . 0 8 4 3 . 8 5 ± 1 0 . 2 6 4 5 . 6 7 ± 1 0 . 2 9 a 2 . 8 8＊

2.2 不同浓度CG处理HaCaT细胞对上清液中IL-2、IL-4相对含量的影响低浓度组上清液中IL-2的浓度与空白对照组无明显差异（P＞0.05）；中、高浓度组IL-2浓度明显低于空白对照组及低浓度组，且高浓度组低于中浓度组（均P＜0.05）。高浓度组CG作用HaCaT细胞后24 h，培养上清液中IL-4的浓度高于空白对照组（P＜0.05），其余3组间差异均无统计学意义，见表1。

3 讨论

CG提纯以β体甘草酸为主要成分，辅以甘草酸苷、甘氨酸、半胱氨酸等成分，其化学结构与可的松或醛固酮的类固醇环相似，作用类似于糖皮质激素，但又无糖皮质激素的不良反应，具有药理作用强、毒性小的优点。研究已证实CG对肝脏类固醇代谢酶△4-5β还原酶有强亲和力，阻止可的松和醛固酮的灭活，从而发挥类固醇样作用，可诱生γ-干扰素（IFN-γ），增强自然杀伤（NK）细胞活性，降低天冬氨酸转氨酶与丙氨酸转氨酶，抑制肝细胞变性坏死与肝原纤维增生，促进肝脏胆红素代谢，提高解毒能力［7］，因此过去的几十年一直广泛用于肝损伤相关疾病的治疗。后来有些学者发现CG可直接与磷脂酶A2结合，还可作用于花生四烯酸使其产生炎性介质，选择性阻断酶的磷酸化，从而抑制前列腺素和白三烯等炎症介质的产生，抑制补体系统的激活途径，直接发挥抗炎作用［8］。此外，CG还可活化T细胞，诱导干扰素产生，调节Th1/Th2比值动态平衡，激活

NK细胞，调节T细胞活性，因此临床上大量应用于T细胞介导的炎症性皮肤病，如银屑病、天疱疮等［3］。大量研究已证实银屑病是一种多基因遗传背景下，由多种免疫相关性细胞、细胞因子、炎症介质相互作用的免疫相关性疾病；以角质形成细胞过度增殖和异常分化及炎性细胞浸润为主要特征［9］。银屑病受累皮损的发生、发展和活化T细胞的归巢受体表达有关，它可以促进活化T细胞向皮肤迁移［10］，在银屑病皮肤受损处受到了活化T细胞及其释放的细胞因子网的复杂作用，包括IFN-γ、TNF-α、细胞因子（IL-1、IL-2、IL-6等）与多种趋化因子水平的升高［11］，共同影响角质形成细胞的增殖状态。为研究CG治疗银屑病的作用机制，张汝芝等［12］用不同浓度CG作用于体外培养的角质形成细胞，发现50～200 μL/mL浓度的CG抑制HaCaT细胞增殖的同时，促进角质形成细胞表达CXCR2和TGF-β1分泌。郭波等［13］研究CG对HaCaT细胞表达AQP3的影响，结果发现62.5～125 μL/mL CG可抑制HaCaT细胞生长，同时促进HaCaT细胞表达AQP3。宋璐璐［14］探讨CG对体外银屑病皮损模型的作用及机制，结果显示CG可以减少银屑病皮损组织细胞IL-17的含量，同时增加IL-10的含量。银屑病患者Th1细胞的细胞因子（IL-2、TNF-α、IL-8等）升高导致Th1/Th2细胞因子失衡，因此多数学者认为，银屑病是Th1细胞为主的免疫性疾病。其中IL-2是重要的促炎症性细胞因子，能促进Th1型的免疫反应，其可以通过与IL-2受体的结合，活化T细胞，促进角质形成细胞增殖，产生炎症级联反应而加重银屑病。它亦能增强细胞毒性T细胞的细胞毒活性，诱导IL-2受体表达，促进细胞移动，增强细胞间的接触和诱导细胞分泌细胞因子。IL-4是Th2型细胞主要的细胞因子，是一种免疫负调节因子，可抑制微环境中的Th1细胞及其细胞因子IL-22、IFN-γ等，诱导免疫耐受的作用［15］。但国内外尚鲜见CG对HaCaT细胞分泌IL-2、IL-4影响的报道。本实验通过不同浓度CG体外干预HaCaT细胞后检测上清液IL-2、IL-4的分泌水平，结果发现低至高浓度CG对HaCaT细胞相对活性有一定影响，抑制角质形成细胞的增殖，并且随着药物浓度的增加，细胞的相对活性逐渐降低，抑制作用更明显；在检测浓度范围内，随着浓度的增加，IL-2分泌量明显降低，IL-4分泌量逐渐升高。结合CG的药理作用，笔者推测CG治疗银屑病的作用机制是通过调节作用于活化T细胞分泌的细胞因子，主要是调节Th1型细胞因子的分泌来纠正外周血Th1/Th2平衡失调，减少炎症介质释放，达到改善银屑病症状的效果。

细胞因子在银屑病的发生、发展过程中具有重要的作用，抑制某些细胞因子的合成或阻断其生物活性是生物制剂治疗银屑病的重要研究内容。由于我们的工作仅限于CG对角质形成细胞部分细胞因子影响的研究，至于各细胞因子之间、角质形成细胞与T细胞之间的相互影响和相互作用机制，还需要进一步全面、系统地探讨。

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（2015-04-01收稿 2015-06-10修回）

（本文编辑闫娟）

Effects of glycyrrhizin on the expressions of IL-2 and IL-4 in HaCaT cells

YIN Cuihong，CHE Yamin△
Department of Dermatology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China△

ObjectiveTo observe the effect of glycyrrhizin（CG）on the proliferation and the expressions of interleukin（IL）-2，IL-4 in human keratinocytes cell line HaCaT cells，and to investigate the therapeutic mechanism of CG in the patients with psoriasis.MethodsThe HaCaT cells were divided into four groups:blank group（without CG），low concentration group（50 μL CG/mL cell supernatant），medium concentration group（100 μL CG/mL cell supernatant）and high concentration group（200 μL CG/mL cell supernatant）.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to evaluate the proliferation of HaCaT cells that were treated with CG at different concentrations respectively for 24 hours.The contents of IL-2 and IL-4 in HaCaT cells were examined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.ResultsCompared with the blank group，there were obviously inhibitory effects in the proliferation of HaCaT cells treated by low，medium and high concentrations of CG for 24 hours.There was no significant difference in IL-2 level between low concentration CG group and blank group（ng/L：234.51±17.98 vs 225.31±16.23，P＞0.05）.After 24 hours of intervention with CG of medium and high concentrations，the expression levels of IL-2 was significantly lower in HaCaT cells than that in blank group and low concentration group.The IL-2 level was significantly lower in high concentration group than that in medium concentration group（ng/L: 188.99±19.22 vs 208.49±18.40，P＜0.05）.At the same condition，the secretion of IL-4 in HaCaT cells was significantly upregulated in high concentration group than that in other three groups（ng/L:45.67±10.29 vs 37.62±3.90，39.68±6.08，43.85± 10.26，P＜0.05）.ConclusionGlycyrrhizin may suppress the proliferation of human skin keratinocytes by regulating secretion of cytokines IL-2 and IL-4.

compound glycyrrhizin；HaCaT cell；interleukin-2；interleukin-4；cell proliferation

R751

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.005

中华医学会皮肤性病学分会美能皮肤病学研究基金（SNMC-201201）

天津医科大学总医院皮肤科（邮编300052）

尹翠红（1981），女，硕士在读，主要从事银屑病的发病机制与治疗的研究

△通讯作者E-mail：lily_alan@sohu.com