川续断皂苷Ⅵ对小鼠骨髓基质细胞ST-2成脂分化的影响及其机制研究

2015-11-24王海晓崔壮王宝利边育红郑纺

天津医药 2015年12期

王海晓，崔壮，王宝利，边育红，郑纺△

细胞与分子生物学

王海晓1，崔壮2，王宝利3，边育红1，郑纺1△

目的观察川续断皂苷Ⅵ（AsperosaponinⅥ，ASAⅥ）对脂肪细胞分化的影响及Wnt通路的调节。方法以小鼠骨髓基质细胞系ST-2为研究对象，将其分为对照组、成脂分化组以及4个不同剂量的ASAⅥ组。其中对照组加入溶媒，成脂分化组加入成脂诱导分化试剂，ASAⅥ组除加入成脂诱导分化试剂外，使用不同浓度（10-7、10-6、10-5、10-4mol/L）的ASAⅥ干预细胞。各组细胞处理5 d后，行油红O染色，观察脂滴形成情况并计算成脂率进行定量分析；荧光定量PCR（FQ-PCR）检测成脂相关基因PPARγ、FABP4和Wnt/β-连环素（β-catenin）通路蛋白β-catenin的mRNA表达水平；Wnt通路抑制剂DKK1干预诱导成脂分化的ST-2细胞5 d，FQ-PCR检测ASAⅥ所调节的PPARγ、FABP4和β-catenin mRNA表达水平。结果与成脂分化组相比，10-5mol/L和10-4mol/L ASAⅥ组中分化的脂肪细胞显著减少，10-5、10-4mol/L ASAⅥ明显抑制PPARγ、FABP4的mRNA表达，但上调β-catenin mRNA表达。DKK1能够逆转ASAⅥ对ST-2细胞成脂分化的抑制作用，促进PPARγ、FABP4的mRNA表达，抑制β-catenin的mRNA表达。结论ASAⅥ能显著抑制ST-2细胞的成脂分化，这一作用可能是通过Wnt/β-catenin通路的激活所介导的。

成脂分化；β连环素；川续断皂苷Ⅵ；骨髓基质细胞；Wnt信号通路

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种具有多向分化潜能的干细胞，是脂肪细胞和成骨细胞的共同前体。生理状态下，BMSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化维持相对平衡。某些病理状态下，成骨成脂分化平衡被打破，调控BMSCs向成骨或成脂某一方向分化的作用占优势，往往会削弱其向另一方向分化［1］。续断是中医临床上常用的补肾中药，始载于《神农本草经》，具有补肝肾、强筋骨、续折伤等功效。川续断皂苷Ⅵ（AsperosaponinⅥ，ASAⅥ）是续断的活性成分，药典中将其作为续断的质控标准［2］。体外研究表明，ASAⅥ能够促进大鼠BMSCs向成骨细胞增殖和分化，该作用可能是通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）蛋白的活性来实现的［3］。然而ASAⅥ对干细胞成脂分化的影响及调控的信号通路还不十分清楚。本研究以小鼠骨髓基质细胞系ST-2为研究对象，观察ASAⅥ对ST-2细胞成脂分化的影响，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料小鼠骨髓基质细胞系ST-2由天津医科大学王宝利研究员惠赠；ASAⅥ购自天津一方科技有限公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、地塞米松（Dexamethasone，DXM）、胰岛素（Insulin，INS）、吲哚美辛（Indometacin，INDO）和油红O为美国Sigma公司产品；胎牛血清（FBS）、α-MEM培养基、胰蛋白酶为美国Hyclone公司产品；TRIZOL、定量PCR试剂盒为美国Invitrogen公司产品；MMLV逆转录酶为Promega公司产品；引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；重组人DKK1蛋白为以色列ProSpec公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓基质细胞系ST-2的培养与诱导成脂分化复苏冻存的小鼠骨髓基质细胞系ST-2，使用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2条件下培养。每隔2～3 d换液1次。待细胞融合达80%～90%时，将其传代培养并诱导成脂分化。具体过程为先使用添加了成脂诱导分化试剂0.25 mmol/L IBMX、0.5 μmol/L DXM、5 mg/L INS、50 μmol/L INDO的含10%FBS的α-MEM培养基培养细胞3 d，再换以仅添加5 mg/L INS的含10%FBS的α-MEM培养基培养2 d。

1.2.2 细胞分组及处理将ST-2细胞分为6组，分别为对照组、成脂分化组和4个不同剂量ASAⅥ组。对照组只加入等体积的溶媒；成脂分化组加入成脂诱导分化试剂进行诱导分化培养（如1.2.1所述）；各ASAⅥ组除加入成脂诱导分化试剂外，分别使用10-7、10-6、10-5、10-4mol/L的ASAⅥ对细胞予以干预。

1.2.3 油红O染色检测脂肪细胞的分化ST-2细胞诱导成脂分化培养5 d后移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次，而后细胞依次使用4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗1 min，60%异丙醇浸洗1 min，油红O染色10 min，蒸馏水漂洗2 min；最后，于倒置显微镜下观察脂肪细胞的生成情况并拍照，计算成脂率（%）=脂肪细胞数/总细胞数，定量分析各组脂肪细胞的生成情况。

1.2.4 荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR，FQPCR）检测脂肪细胞特异性基因的表达各组细胞诱导成脂分化5 d后，收获细胞，提取细胞总RNA，具体操作过程依据TRIZOL试剂说明书进行。使用MMLV逆转录酶将2 μg的总RNA逆转录合成为cDNA第一链。以cDNA为模板，FQPCR检测脂肪细胞特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome Proliferator-Activated receptor-γ，PPARγ）、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（Fatty-acid-binding protein 4，FABP4）和Wnt通路蛋白β-连环素（β-catenin）的mRNA表达。FQ-PCR反应体系为：cDNA 5 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，2×SYBR GREEN PCR Master Mix 10 μL，无RNA酶水补足反应体系至20 μL。反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性10 s、58℃退火10 s、72℃延伸10 s，进行35次循环。PCR产物采用溶解曲线法分析，以明确样品扩增的特异性。管家基因GAPDH作为内参基因标准化目的基因的表达。目的基因的相对表达量采用2-∆∆Ct法计算。其中∆∆Ct=（目的基因Ct值-GAPDH Ct值）实验组-（目的基因Ct值-GAPDH Ct值）对照组。引物序列见表1。

Tab.1Primer sequence of genes that were amplified by FQ-PCR表1 FQ-PCR检测的基因引物序列

1.2.5 Wnt通路抑制剂DKK1对ASAⅥ抑制的脂肪细胞分化的影响采用Wnt通路抑制剂DKK1（0.3 mg/L）预处理诱导成脂分化的ST-2细胞1 h，而后再加入10-4mol/L的ASAⅥ继续干预细胞5 d。收获细胞，提取总RNA，FQ-PCR检测脂肪细胞特异性基因PPARγ、FABP4和Wnt通路蛋白βcatenin的mRNA表达。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASAⅥ对ST-2细胞成脂分化的影响对照组

ST-2细胞中仅有（4.531±0.922）%细胞分化成脂肪细胞，成脂分化组中可见（83.074±1.013）%细胞分化为脂肪细胞；10-7、10-6、10-5和10-4mol/L ASAⅥ组的成脂率分别为（76.908±2.372）%、（70.323±3.541）%、（53.258±2.049）%、（42.293±2.774）%（n=6，F= 951.514，P＜0.01），随ASAⅥ浓度增加，成脂率依次降低（P＜0.01），并呈现剂量依赖关系。

2.2 ASAⅥ对PPARγ、FABP4和β-catenin mRNA表达的影响与对照组比较，成脂分化组的PPARγ、FABP4 mRNA表达显著升高，约为对照组的7.9倍和8.3倍，而β-catenin的mRNA水平明显降低，约为对照组的41%。ASAⅥ干预后，10-5、10-4mol/L ASAⅥ明显抑制PPARγ、FABP4的mRNA表达，但明显上调β-catenin的mRNA表达。与成脂分化组比较，10-5、10-4mol/LASAⅥ对PPARγ mRNA的抑制率分别为37.8%和45.1%；对FABP4 mRNA的抑制率分别为45.0%和57.2%；10-5、10-4mol/L ASAⅥ组β-catenin mRNA表达水平分别为成脂分化组的2.88和3.54倍。见表2。

Tab.2Relative transcription levels of PPARγ，FABP4 and β-catenin in differentiated ST-2 adipocyte表2 ASAⅥ对诱导成脂分化的ST-2细胞中PPARγ、FABP4和β-catenin mRNA的相对表达水平（n=6，）

＊＊P＜0.01；将对照组设定为1，a与（1）组比较，b与（2）组比较，c与（3）组比较，d与（4）组比较，P＜0.05

β -c a t e n i n 1 . 0 0 ± 0 . 1 9 0 . 4 1 ± 0 . 0 7 a 0 . 4 9 ± 0 . 0 9 a 0 . 5 7 ± 0 . 0 6 a b 1 . 1 8 ± 0 . 1 9 a b cd1 . 4 5 ± 0 . 2 3 a b cd4 5 . 3 7 5＊＊组别对照组（1）成脂分化组（2）1 0 -7 m o l / L A S AⅥ组（3）1 0 -6 m o l / L A S AⅥ组（4）1 0 -5 m o l / L A S AⅥ组（5）1 0 -4 m o l / L A S AⅥ组（6）F P P A R γ 1 . 0 0 ± 0 . 1 2 7 . 9 1 ± 1 . 0 5 a 7 . 3 5 ± 1 . 2 8 a 7 . 2 1 ± 1 . 0 4 a 4 . 9 2 ± 0 . 7 9 a b c d 4 . 3 4 ± 0 . 6 6 a b c d 5 0 . 1 0 4＊＊F A B P 4 1 . 0 0 ± 0 . 2 7 8 . 3 2 ± 1 . 3 9 a 7 . 8 5 ± 1 . 2 1 a 7 . 6 1 ± 1 . 0 7 a 4 . 5 8 ± 0 . 8 3 a b c d 3 . 5 6 ± 0 . 7 6 a b c d 5 2 . 3 8 6＊＊

2.3 Wnt通路抑制剂减弱ASAⅥ对脂肪细胞分化的抑制作用选择抑制作用最明显的10-4mol/L ASAⅥ开展进一步实验。Wnt通路抑制剂DKK1能够逆转ASAⅥ对脂肪细胞分化的抑制作用。与10-4mol/L ASAⅥ组相比，DKK1组PPARγ、FABP4的mRNA表达水平显著增加，分别为ASAⅥ组的1.61和2.04倍；而β-catenin mRNA的表达水平明显降低，约为ASAⅥ组的52.8%。见表3。

Tab.3Effect of DKK1 on transcription levels of PPARγ，FABP4 and β-catenin that were regulated by ASAⅥ表3 Wnt通路抑制剂DKK1对ASAⅥ调节的PPARγ、FABP4和β-catenin mRNA表达的影响（n=6，）

＊＊P＜0.01；将成脂分化组设定为1，a与（1）组比较，b与（2）组比较，P＜0.05

组别成脂分化组（1）1 0 -4 m o l / L A S AⅥ组（2）D K K 1干预组（3）F P P A R γ 1 . 0 0 ± 0 . 2 2 0 . 5 7 ± 0 . 2 1 a 0 . 9 2 ± 0 . 1 8 b 7 . 5 3 7＊＊F A B P 4 1 . 0 0 ± 0 . 1 3 0 . 4 8 ± 0 . 0 9 a 0 . 9 8 ± 0 . 1 7 b 2 7 . 2 2 0＊＊β -c a t e n i n 1 . 0 0 ± 0 . 1 4 2 . 6 3 ± 0 . 2 5 a 1 . 3 9 ± 0 . 2 7 a b 8 4 . 1 2 8＊＊

3 讨论

3.1 BMSCs成骨成脂分化平衡及其调控脂肪细胞是哺乳动物体内一类重要的功能细胞，在维持脂类代谢与能量平衡方面具有关键作用。脂肪细胞和成骨细胞共同起源于BMSCs，两者的分化存在“此消彼长”的动态平衡，如在各类骨丢失性疾病的发生过程中，骨量的减少往往伴随着骨髓中脂肪细胞的增多。BMSCs分化为成熟脂肪细胞受到许多转录因子如PPARγ和FABP4等和信号通路的调节。PPARγ属于核激素受体超家族，是一类依赖配体激活的核转录因子，在脂肪细胞分化调控网络中发挥着不可或缺的作用［4］。研究表明，BMSCs中的PPARγ活化后抑制成骨细胞特异性转录因子核心结合因子a1（core binding factor a1，Cbfa1）和Osterix等的表达，阻碍成骨细胞分化并加强脂肪细胞分化，促进脂肪组织生成；反之，若PPARγ基因发生突变，则脂肪细胞分化削弱，而成骨细胞分化加强，进而促进骨形成［5］。FABP4基因也称为aP2，属于脂肪酸结合蛋白家族，是脂肪细胞分化成熟的标志基因，广泛参与了脂肪酸的跨膜转运及代谢过程［6］。经典Wnt信号途径，亦称Wnt/β-catenin信号途径，是调控脂肪细胞分化的分子开关。体内、外研究均表明Wnt通路能够抑制脂肪细胞的分化［7］。

3.2 ASAⅥ对成骨成脂分化的影响续断，又名和尚头，为川续断科多年生草本植物川续断的根，因能“续折接骨”而得名。续断在中医临床主要用于腰膝酸软、跌扑损伤、风湿痹痛、崩漏、胎漏等的治疗。现代研究认为续断的主要活性成分ASAⅥ能够促进大鼠BMSCs的增殖和骨向分化，提高成骨细胞的活性和数量。此外，陈小宇等［8］研究表明，ASAⅥ能够以剂量依赖的方式抑制3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化。这些研究提示ASAⅥ可通过改善成骨成脂分化平衡失调来发挥其防治骨质疏松、促进骨折愈合的功效。然而目前尚鲜见关于ASAⅥ对干细胞成脂分化的影响及作用机制的报道。因此，笔者在本文中进行了ASAⅥ对骨髓基质细胞ST-2成脂分化的机制研究。

本研究中，在成脂诱导分化试剂作用下，成脂分化组的PPARγ和FABP4的基因表达水平与对照组相比显著升高，ASAⅥ处理后PPARγ、FABP4的mRNA表达水平急剧减低。油红O染色结果也印证了基因表达的结果，即成脂诱导分化试剂作用下骨髓基质细胞ST-2分化为含大量脂滴的脂肪细胞，而ASAⅥ干预后，脂肪细胞的生成明显受到抑制。ASAⅥ干预后，诱导成脂分化的ST-2细胞中的β-catenin mRNA表达水平明显升高；而Wnt通路抑制剂DKK1作用后，能够下调ASAⅥ促进的βcatenin mRNA表达并上调ASAⅥ抑制的PPARγ、FABP4 mRNA表达，表明DKK1在一定程度上能够逆转ASAⅥ对ST-2细胞成脂分化的抑制作用，这一结果也说明Wnt/β-catenin通路的激活介导了ASAⅥ对脂肪细胞分化的抑制作用。

［1］Fan Q，Tang T，Zhang X，et al.The role of CCAAT/enhancer binding protein（C/EBP）-alpha in osteogenesis of C3H10T1/2 cells induced by BMP-2［J］.J Cell Mol Med，2009，13（8B）:2489-2505.doi: 10.1111/j.1582-4934.2008.00606.x.

［2］National pharmacopoeia committee.Pharmacopoeia of the People′s Republic of China 2010 Edition，1 Volume［S］.Beijing:China Medical Science Press.［国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010:231］.

［3］Niu Y，Li Y，Huang H，et al.AsperosaponinⅥ，a saponin component from Dipsacus asper wall，nduces osteoblast differentiation through bone morphogenetic protein-2/p38 and extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway［J］.Phytother Res，2011，25（11）:1700-1706. doi:10.1002/ptr.3414.

［4］Siersbaek R，Nielsen R，Mandrup S.PPARgammain adipocyte differentiation and metabolism novel insights from genome-wide studies［J］. FEBS Let，2010，584（15）:3242-3249.doi:10.1016/j.febslet.2010. 06.010.

［5］Zhang C.Molecular mechanisms of osteoblast-specific transcription factor Osterix effect on bone formation［J］.Beijing Da Xue Xue Bao，2012，44（5）:659-665.［张弛.成骨细胞特异性转录因子Osterix对骨形成作用的分子机制［J］.北京大学学报医学版，2012，44（5）: 659-665］.

［6］Sanz C，Vázquez P，Blázquez C，et al.Signaling and biological effects of glucagon-like peptide 1 on the differentiation of mesenchymal stem cells fromhuman bone marrow［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，298（3）:E634-643.doi:10.1152/ajpendo.00460.2009.

［7］Li PH，Liu YY，Cui L.Regulating effects of Wnt signaling pathway on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts and adipocytes［J］.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2010，14（10）:1749-1754.［李萍华，刘钰瑜，崔燎.骨髓间充质干细胞成脂和成骨过程中wnt信号通路的调控［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，14（10）:1749-1754］.

［8］Chen XY，Zhu AZ，Liu CC，et al.Effect of asperosaponinⅥon proliferation and differentiation of 3T3-L1 cells［J］.Chinese Pharmacological Bulletin，2013，29（8）:1150-1154.［陈小宇，祝爱珍，刘成成，等.川续断皂苷Ⅵ对3T3-L1细胞的增殖和分化影响［J］.中国药理学通报，2013，29（8）:1150-1154］.

（2015-07-06收稿 2015-08-31修回）

（本文编辑李鹏）

Effect of AsperosaponinⅥon adipocyte differentiation in ST-2 cells and its underlying mechanisms

WANG Haixiao1，CUI Zhuang2，WANG Baoli3，BIAN Yuhong1，ZHENG Fang1△
1 College of Integrated Traditional and Western Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2 College of Public Health，Tianjin Medical University；3 Key Laboratory of Hormone and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital&Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University△

ObjectiveThe effect of AsperosaponinⅥ（ASAⅥ）on adipocyte differentiation and the involvement of Wnt signal pathway was investigated.MethodsThe murine bone marrow stromal cell line ST-2 were divided into 6 groups:control group，adipocyte differentiation group，and 4 different doses of ASAⅥgroups.Control group was exposed to the vehicle，adipocyte differentiation group was exposed to adipogenic reagent，and those 4 ASAⅥgroups were treated with different concentration（10-7，10-6，10-5，10-4mol/L）of ASAⅥafter adipocyte differentiation induction.5 days later，oil red O staining was performed to calculate adipocyte rate.Then mRNA transcription levels of PPARγ，FABP4 genes and β-catenin that were Wnt/β-catenin signaling pathway proteins were examined by FQ-PCR.Then Wnt pathway inhibitor DKK1 was supplemented into ST-2 cells treated with 10-4mol/L ASAⅥfor 5 days.After that FQ-PCR was used to detect whether transcription levels of PPARγ，FABP4 and β-catenin in ST-2 cells were changed.ResultsCompared with adipocyte differentiation group 10-5mol/L and 10-4mol/L ASAⅥtreatments greatly down-regulated the number of lipid droplets and markedly inhibited transcription levels of adipocyte characterization transcription factors included PPARγ，FABP4 while up-regulated transcription level of β-catenin in ST-2 cells.DKK1 can reverse the inhibitory effect of ASAⅥon adipocyte differentiation in ST-2 adipocyte.The transcription levels of PPARγ and FABP4 were up-regulated significantly while transcription level of β-catenin was inhibited.ConclusionASAⅥblocks adipocyte differentiation in ST-2 cells which might be mediated through activating Wnt/β-catenin signaling pathway.

adipocyte differentitation；beta catenin；AsperosaponinⅥ；bone marrow stromal cells；Wnt signal pathway

R285.5

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.001

国家自然科学基金资助项目（81102543，81200611）；中国博士后基金面上项目（2012M520588）

1天津中医药大学中西医结合学院（邮编300193）；2天津医科大学公共卫生学院；3天津医科大学代谢病医院内分泌研究所

王海晓（1989），男，硕士在读，主要从事中西医结合防治代谢性骨病方面的研究

△通讯作者E-mail：zhengfang_1979@163.com