肝细胞癌组织HBXIP和GRIM-19表达及意义的探讨

孙纪三，张建军，高伟，杨涛，郭庆军，马楠，王洪海，蒋文涛

肝细胞癌组织HBXIP和GRIM-19表达及意义的探讨

孙纪三，张建军，高伟，杨涛，郭庆军，马楠，王洪海，蒋文涛△

目的探讨乙肝病毒X蛋白结合蛋白HBXIP和细胞凋亡调节因子GRIM-19在肝细胞癌组织中的表达及意义。方法收集42例肝细胞癌组织和28例正常肝脏组织，采用免疫组织化学法检测两种组织中HBXIP和GRIM-19的表达。结果在肝细胞癌组织和正常肝脏组织中，HBXIP阳性表达率分别为80.95%（34/42）和42.86%（12/28）；而GRIM-19阳性表达率分别为40.48%（17/42）和75.00%（21/28），差异有统计学意义（P＜0.01）。肝细胞癌组织中HBXIP的阳性表达率在低、未分化和Ⅲ～Ⅳ期的表达水平高于高、中分化和Ⅰ～Ⅱ期组织；而GRIM-19的阳性表达率与之相反，且无门脉癌栓组织中GRIM-19的阳性表达率高于有门脉癌栓组织。HBXIP与GRIM-19表达呈负相关（rs=-0.400，P＜0.01）。结论HBXIP和GRIM-19的异常表达可能与肝细胞癌的发生及浸润转移有密切关系。

癌，肝细胞；肿瘤转移；免疫组织化学；乙肝病毒X蛋白结合蛋白；GRIM-19

长期的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染容易导致原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生［1］。研究表明，乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）可诱导细胞凋亡，参与肝癌的发生与发展［2］。乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白（hepatitis B virus X-interactingprotein，HBXIP）是由91个氨基酸组成的蛋白，具有重要的生物活性［3］；HBXIP可与HBx的C端特异性结合，降低HBx的活性［4］；而细胞凋亡调节基因19（genes associated with retinoid interferon induced mortality 19，GRIM-19）是一种调亡基因，受维甲酸和干扰素的共同诱导［5］。但HBXIP和GRIM-19在HCC中的表达、分布及两者在HCC发生发展中的作用尚鲜见报道。本文采用免疫组织化学法检测人肝细胞癌组织中HBXIP和GRIM-19蛋白的表达，以探讨HBXIP和GRIM-19在肝细胞癌组织中的表达与肿瘤的生成、发展及转移的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集2011年1月—2013年9月天津市第一中心医院接受HCC手术治疗患者术后存档的石蜡标本42例，年龄31～73岁，平均（50.7±17.5）岁，均经我院病理科确诊，且病史资料完整，术前均未行放疗、化疗及生物剂治疗。组织学分级按2003年国际抗癌联盟（UICC）和美国肿瘤联合会（AJCC）联合制定的TNM分期法，高、中分化29例，低、未分化13例；TNM分期按2010年美国癌症研究联合会癌症分期手册第7版标准，Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期27例；有门静脉血栓14例，无门静脉血栓28例。所有患者均有完整临床资料。另取同时期正常肝脏存档石蜡标本28例。

1.2 主要试剂HBXIP鼠抗人抗体和GRIM-19鼠抗人抗体均为美国Sigma公司产品，工作浓度均为1∶200；SP-0023免疫组化试剂盒（美国ZYMED公司）；DAB显色试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）。其他试剂均为分析纯。

1.3 方法收集病理科登记的HCC患者及肝脏正常的患者的临床资料与存档肝脏石蜡标本，统计HCC病因、甲胎蛋白（AFP）水平、肿瘤大小、门静脉癌栓情况、组织分型、TMN分期等临床病理学参数。每例蜡块4µm厚连续切片3张，其中1张进行HE染色，另2张进行免疫组化染色。石蜡切片常规脱蜡至水化，微波抗原修复15 min，3%H2O2室温孵育。加封闭血清，滴加一抗，4℃过夜，滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，DAB显色。苏木素复染2 min，盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定选用试剂盒中的阳性片作为阳性对照，PBS取代一抗作为阴性对照。HBXIP、GRIM-19表达于细胞质，染色呈棕黄色视为阳性。每张切片随机读取5个高倍视野（×200），每个视野计数100个细胞，采用半定量积分法依据染色强度和阳性细胞百分率判断染色结果［6-7］。所有切片均由2位病理科医师在双盲情况下独立观察判断，对判断不一致的病例，共同进行观察后得出一致结论。

1.5 统计学方法应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计数资料采用例表示，样本率的比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.12 组肝脏组织中HBXIP的表达与分布HBXIP染色主要定位于细胞质，在癌细胞中可见大量棕黄色染色，在正常肝细胞中呈弱阳性表达，见图1。肝癌组织HBXIP的阳性表达率高于正常肝组织（P＜0.01），见表1。

Fig.1The expression of HBXIP in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma（IHC，×200）图1 HBXIP在正常肝脏组织和肝细胞癌组织中的表达（IHC，×200）

Tab.1The expression of HBXIP in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma表1 HBXIP在正常肝脏组织和肝细胞癌组织中的表达

2.22 组肝脏组织中GRIM-19的表达与分布GRIM-19染色主要定位于细胞质，见图2。在肝细胞癌组织的阳性表达率低于正常肝组织（P＜0.01），见表2。

Fig.2The expression of GRIM-19 in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma（IHC，×200）图2 GRIM-19在正常肝脏组织和肝细胞癌组织中的表达（IHC，×200）

2.3 HBXIP和GRIM-19在不同临床特征下阳性表达率比较HBXIP在低、未分化肝癌中的阳性率明

显高于高、中分化者，Ⅲ～Ⅳ期肝癌组织中HBXIP的阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期；而HBXIP在HCC病因、门静脉栓塞情况、AFP水平、肿瘤大小等方面的阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。GRIM-19在高、中分化肝癌中的阳性率高于低、未分化者；Ⅰ～Ⅱ期肝癌组织中HBXIP的阳性表达率率高于Ⅲ～Ⅳ期；无门静脉栓塞者的阳性率高于有门静脉栓塞者；而在HCC病因、AFP水平、肿瘤大小等方面阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

Tab.2The expression of GRIM-19 in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma表2 GRIM-19在正常肝脏组织和肝细胞癌组织中的表达

Tab.3Correlation between expressions of HBXIP and GRIM-19 with pathological features in hepatocellular carcinoma表3 肝细胞癌中HBXIP与GRIM-19阳性表达与临床病理参数的关系例（%）

2.4 HBXIP和GRIM-19在肝细胞癌中表达的关系HBXIP和GRIM-19两种蛋白在肝细胞癌中的阳性表达呈负相关（P＜0.01），见表4。

Tab.4Relationship of HBXIP and GRIM-19 expression in hepatocellular carcinoma表4 HBXIP和GRIM-19在肝细胞癌中表达的关系（例）

3 讨论

3.1 HBXIP在肿瘤中的作用HBXIP基因定位于人染色体1p13.3，其表达的蛋白首次于肝癌细胞株HepG2中被发现，为乙肝病毒编码的蛋白HBx的相互作用的因子。研究发现，HBXIP为具有多功能的调节蛋白，可通过不同的分子途径发挥调控作用［8］。HBXIP可与凋亡抑制因子survivin形成复合物，同时结合pro-caspase-9，使survivin通过细胞色素C介导的凋亡途径抑制细胞凋亡，从而使得HBXIP对肝癌细胞的增殖具有促进作用，因此推测HBXIP与肝细胞癌的发生与发展有密切关联［9］。为了进一步阐明其分子机制，王凤泽等［4］通过基因共转染将核因子（NF）-κB报告基因质粒pNF-κB-Luc和HBXIP真核表达载体pcDNA3-hbxip导入人肝癌H7402细胞系中，进行荧光素酶活性分析，研究显示HBXIP可增加细胞核内NF-κB蛋白水平，进而发挥NF-κB促转录调控的作用。因此，HBXIP可通过调控NF-κB信号途径而促进肝癌细胞增殖；同时有研究发现HBXIP在乳腺癌细胞中过表达［10］，HBXIP通过转录因子Spl激活Skp2的启动子活性［11］，上调S期激酶相关蛋白（Skp2）、乳腺肿瘤自身抗原（LMO4）的表达，而HBXIP通过上调Skp2、LMO4可促进乳腺癌癌细胞的迁移［12］。

3.2 GRIM-19蛋白在肿瘤中的作用GRIM-19是GRIM家族一员，其定位于19p13.2，它包含着一个开放读码框，其编码的蛋白质含有144个氨基酸残基。GRIM-19主要定位于胞质中的线粒体内膜上，在受到外界刺激后表达量增多，并能从线粒体中释放而进入细胞核。GRIM-19被认为是一种调亡基因，受维甲酸和干扰素的共同诱导［13］；同时GRIM-19为线粒体中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶Ⅰ复合物的亚单位，在线粒体Ⅰ型呼吸过程中起着至关重要的作用。多项研究表明，GRIM-19参与细胞的增殖、凋亡的调控过程［14］，其表达降低或位点突变可以导致细胞的异常增殖和恶性转化［15］，在肿瘤的发生与发展过程中发挥重要作用［5，16］。

3.3 HBXIP与GRIM-19蛋白在肝细胞癌组织和正常肝脏组织中的表达本研究显示，HBXIP在正常肝组织表达水平较低，而在肝细胞癌组织中呈过量表达，两组相比具有明显的差异性；而GRIM-19在肝细胞癌组织中的表达水平相对正常肝组织明显减少。通过统计肝细胞癌中HBXIP和GRIM-19表达与临床病理学特征的关系，发现肝细胞癌细胞分化程度越高，HBXIP阳性表达率越低；Ⅰ～Ⅱ期肝癌组织中HBXIP的表达水平比Ⅲ～Ⅳ期低；有门静脉癌栓肝癌组织中的阳性率与无门静脉栓塞者无差异；而GRIM-19在低、未分化、Ⅲ～Ⅳ期、有门静脉栓塞肝癌组表达均降低，且2种蛋白在AFP水平、肿瘤大小等方面的表达无差异。本研究提示HBXIP、GRIM-19在肝细胞癌组织中的异常表达可能与肝癌细胞发生、进展，以及肿瘤向周围组织的侵袭、迁移之间有着高度的关联性，从而为癌细胞转移的研究提供理论依据。此外，本研究显示2种蛋白在肝细胞癌中的表达呈负相关，因此推测HBXIP蛋白表达增加和GRIM-19表达减少在肝细胞癌发生发展、侵袭转移过程中存在拮抗作用。

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（2015-05-08收稿 2015-08-08修回）

（本文编辑 李鹏）

Expressions of HBXIP and GRIM-19 in hepatocellular carcinoma and their clinic significance

SUN Jisan，ZHANG Jianjun，GAO Wei，YANG Tao，GUO Qingjun，MA Nan，WANG Honghai，JIANG Wentao△
Tianjin First Central Hospital of Oriental OrganTransplant Center，Tianjin 300192，China△

ObjectiveTo investigate the expressions of HBXIP and GRIM-19 in hepatocellular carcinoma tissues and their clinic significance.MethodsHepatocellular carcinoma tissue（n=42）and normal liver tissue（n=28）were collected from Tianjin First Central Hospital，immunohistochemistry was used to detect the expressions of HBXIP and GRIM-19 in these two groups.ResultsRate of cells with positive expressions of HBXIP in hepatocellular carcinoma and normal liver tissues were 80.95%（34/42）and 42.86%（12/28）respectively；Rate of cells with positive expression of GRIM-19 in hepatocellular carcinoma tissues and normal liver tissues was 40.48%（17/42）and 75.00%（21/28）respectively，and the difference between these two groups was statistically significant（P＜0.05）；The expression of HBXIP was higher but the expression of GRIM-19 was lower in poor differentiated and stageⅢ-IV cells than those in well and moderate differentiated cells and in stage I-II，cells.What′s more，the expression of GRIM-19 is higher in tissue without portal thrombosis than that in tissue with portal thrombosis.The expression of HBXIP was negatively correlated with GRIM-19 expression（rS=-0.400，P＜0.01）. ConclusionThe abnormal expressions of HBXIP and GRIM-19 may play important roles in the process of development and metastasis of hepatocellular carcinoma.

carcinoma，hepatocellular；neoplasm metastasis；immunohistochemistry；HBXIP；GRIM-19

R735.7

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.006

天津市科技计划项目（10ZCGYSF00500）

天津市第一中心医院东方器官移植中心（邮编300192）

孙纪三（1980），男，主治医师，硕士，主要从事肝脏移植方面研究

△通讯作者E-mail：jiang-wentao@medmail.com.cn