MiR-340经组织型纤溶酶原激活剂调控施万细胞的纤溶能力*

张锐锐，龚蕾蕾，王珊珊，陈倩倩，顾晓松，李石营

（南通大学江苏省神经再生重点实验室，江苏226001）

在转录后水平调控基因表达的microRNA（miRNA）是一类约22个核苷酸的短链非编码RNA，通过降解靶基因mRNA或者阻碍靶基因的翻译来下调靶基因的表达，广泛参与机体的各种生理及病理过程[1-3]。周围神经因炎症反应、髓鞘崩解，从而产生髓鞘碎片和胶原纤维等堆积物阻碍轴突向前生长。组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，tPA）是一种丝氨酸蛋白酶，能够把无活性的纤溶酶原激活成有活性的纤维蛋白溶酶（plasmin），是清除这些堆积物的主要蛋白酶[4-6]。我们研究发现miR-340可抑制施万细胞的纤溶能力，靶基因预测分析发现tPA是miR-340的潜在靶基因，因此我们构建tPA的荧光素酶报告质粒，通过双基因报告系统确定miR-340可直接作用于tPA的3'UTR，从而负性调控靶基因tPA的表达。

1 材料和方法

1.1 纤溶实验 用12孔板制作纤维蛋白板，将低熔点琼脂糖溶于0.01mol/L PBS中，制成1%低熔点琼脂糖凝胶。每孔包含0.8 mL琼脂糖溶液、thrombin（0.125 unit）、125 μL fibrinogen （10 mg/mL）、2.5 μL plasminogen（10 u/mL）。无菌条件下，室温放置1 h完全凝固后，在孔中央挖5 mm的小孔。miR-340模拟物、阻遏物（广州锐博生物公司）及各自对照转染永生化的施万细胞RSC96，6 h后移植在纤维蛋白板的小孔中。放入37℃，5%CO2培养箱中，18 h后测量溶圈的宽度。

1.2 tPA 3'UTR的构建 大鼠基因组的制备采用基因组提取PCR试剂盒（福际生物公司）。tPA 3'UTR构建的上游引物为CGGAATTCCAAAGAAAGCCCAGCTCCT，下游引物为CCCTCGAGTAAGTGTGAAAAATACCTTG。用Pyrobest DNA聚合酶从基因组上扩增出目的条带，EcoRI-XhoI双酶切后插入pLUC-UTR报告基因载体（复旦大学惠赠），构建的质粒命名为pLuc-tPA-3'UTR，测序确定构建序列的正确性。

1.3 荧光素酶活性检测 将miR-340模拟物及对照共转染RSC96细胞，转染24 h后，冰冷PBS液收细胞，加入100 μL PLB裂解液室温裂解细胞15 min。取20μL裂解上清加入96孔板，然后加入30 μL LAR II，混匀后立即在荧光/化学发光仪上检测 Firefly荧光素酶活性（F值）。然后每孔再加入15 μL的Stop&Glo溶液检测 Renilla荧光素酶活性（R值），R值与F值的比值为相对荧光强度，反映报告基因的相对表达水平，实验设3次重复。

1.4 大鼠坐骨神经夹伤模型的建立 16只健康成年雄性SD大鼠，体重180～220g，随机分为2组，用复合麻醉剂麻醉大鼠，暴露左侧坐骨神经，在坐骨神经中段夹伤坐骨神经，方法为用止血钳压伤15 s，停3 s，重复2次。在夹伤后的0 h和7 d处死大鼠，取夹伤段坐骨神经用于分析。

1.5 实时定量聚合酶链反应检测 （RT-PCR）mRNA逆转录和miRNA逆转录用MicroRNA Reverse Transcription Kit(Thermo)进行。反应体系如下：10 mM dNTPs 2 μL，Reverse Transcriptase 1μL，5×Reverse Transcription Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 20 U/μL 0.25 μL，逆转录引物 2μL，RNA sample 1 μg，加DEPC水至20 μL。在PCR仪器上运行，37℃ 60 min，70℃5 min。RT-PCR检测以逆转录的cDNA产物为模板，反应体系如下：2×Premix 10 μL，Forward primer 0.4 μL，Reverse primer 0.4 μL，cDNA 1 μL，ROX 0.4 μL，双蒸水 7.8 μL。在 ABI StepOne PCR仪上进行，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，45 个循环。每个反应设置3个复孔，mRNA检测用GAPDH作为内参，miRNA检测用U6作为内参。

1.6 统计学处理 数据采用STATA7.0统计学软件进行分析，组间差异分析采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-340抑制施万细胞的纤溶能力 坐骨神经损伤后的再生过程中，轴突在生长过程中需要穿过髓鞘碎片和胶原纤维等堆积物，因此溶解这些障碍物，清除轴突生长的路障，在坐骨神经损伤后的再生修复过程中具有重要作用。我们在筛选影响施万细胞纤溶能力的miRNA时发现，转染miR-340模拟物的RSC96细胞组，溶圈明显比对照组小。而转染miR-340抑制物的RSC96细胞组，溶圈明显比对照组大（图1），说明miR-340能够抑制施万细胞的纤溶能力。

图1 miR-340能够抑制施万细胞的纤溶能力（*0.01＜P＜0.05）

2.2 miR-340可直接靶向作用于tPA的3'UTR TargetScan和miRanda软件预测分析显示，miR-340可能作用于tPA的3'UTR。我们用荧光素酶双报告基因系统来验证miR-340是否靶向tPA的3'UTR。将miR-340与tPA匹配区的3'UTR构建到p-Luc荧光素酶报告基因的下游，构成报告基因质粒（图2A）。构建的质粒分别与miR-340的模拟物或对照共同转入RSC96细胞中，与对照组相比，miR-340模拟物可显著降低相对荧光强度（图2B）。说明miR-340能直接靶向作用于tPA的3'UTR，从而可以抑制tPA的表达。

图2 miR-340可直接作用于基因tPA的3'UTR（**P＜0.01）

2.3 大鼠坐骨神经再生过程中tPA与miR-340的表达基本呈负相关性 通过RT-PCR来检测夹伤段坐骨神经中tPA和miR-340的表达变化情况，如图3所示，与0 h相比，tPA的mRNA表达在7 d显著增加。而miR-340的表达在7 d显著降低，表明tPA与miR-340的表达呈负相关性。

图3 大鼠坐骨神经再生过程中tPA与miR-340表达变化（**P＜0.01）

3 讨 论

周围神经损伤后近侧端神经发生创伤性溃变，远侧端神经发生瓦勒氏变性[7]，产生的髓鞘碎片和胶原纤维等堆积物阻碍轴突向前生长。tPA主要由施万细胞分泌，是清除这些沉积的髓鞘碎片和胶原纤维的主要蛋白酶。文献报道tPA在周围神经再生过程中具有重要的调控作用，神经损伤后，tPA的分泌迅速增加[8-9]。而tPA敲除的大鼠感觉和运动功能的恢复明显减弱[10]。miRNA在转录后水平调控靶基因的表达，具有迅速、精细、可逆等特点。小的分子属性使它也相对容易通过血--神经屏障，因此是一种新的潜在的治疗靶点。本研究首次报道miR-340可直接靶向tPA的3'UTR，从而通过降低靶基因tPA的表达，抑制施万细胞的纤溶能力。本研究从转录后水平解读了tPA的调控机制，是miRNA在周围神经再生过程中的调控作用的良好补充，也为miR-340作为新的治疗靶点的研究与开发提供了科学前提。

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