FAK基因沉默促进舌癌细胞失巢凋亡及抑制转移的实验研究*

刘华联 ，江宏兵 ，承翼南 ，徐天舒 ，邢树忠

（1常州市第一人民医院口腔科，江苏213001；2江苏省口腔医院·南京医科大学附属口腔医院）

作为一种非受体酪氨酸激酶，粘着斑激酶可通过多种信号分子通路在细胞的运动、迁徙、血管生成等方面发挥重要作用[1-4]。我们通过前期对舌癌原发灶及转移淋巴结的病理分析发现，黏着斑激酶在颊、舌癌等口腔恶性肿瘤中高表达。且表达主要集中在肿瘤生长前沿区及转移区癌细胞中，与颈淋巴结转移的密切相关[5]。本实验以舌癌细胞Tca8113为研究对象，通过设计针对FAK的siRNA，下调舌癌细胞中FAK的表达，进而观察体外实验中FAK对舌癌细胞失巢凋亡及侵袭及迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 Tca8113舌癌细胞系由南京医科大学口腔医学院惠赠，LipofectamineTM2000转染试剂（美国invitrogen公司），鼠抗人FAK抗体、HRP标IgG二抗、羊抗人β-actin单克隆抗体（北京中杉金桥），G418（美国GIBCO公司），蛋白显色试剂盒（美国PIERCE 公司），Poly-HEMA、Transwell小室（美国SIGMA公司）。

1.2 方法

1.2.1 siRNA序列设计合成及鉴定：此部分工作已在前期研究中完成，设计针对FAK的siRNA命名Tca-FAK，对照组命名为NON-siRNA[6]。

1.2.2 基因转染及筛选：细胞培养皿中接种约3×105个Tca8113细胞,常规培养24小时。100μL无血清无三抗的RPMI 1640培养的培养液溶解5μL LipofectamineTM2000和2μg质粒DNA，然后将混合物加入Tca8113细胞中。在37℃、5%CO2条件下继续培养5 h后，换入含10%新生牛血清的常规RPMI 1640培养基。继续培养24小时，改用含G418 400 mg/L的RPMI 1640培养基进行筛选培养。经反复筛选2～3周后，收集具有G418抗性的细胞克隆增殖。实验组及对照组分别命名为Tca-FAK、Tca-NON。未做任何处理的舌癌细胞命名为Tca8113。

1.2.3 免疫细胞化学法：将已消毒的玻片放置于培养皿中，密度为2×106/L的细胞接种于培养板中进行爬片6小时待细胞贴壁后，95%乙醇固定，过氧化酶阻断剂30min、羊血清30min处理后加FAK单抗过夜。然后加入兔抗鼠IgG及SABC复合物，每个步骤间均以PBS（pH：7.14）轻微振洗。最后DAB显色、脱水、透明、封片。实验以PBS代替一抗做为对照参考。

1.2.4 Western blot实验：常规收获细胞，提取蛋白上样，12mA 2h电泳，300mA、30～60min 转膜。使用10%脱脂奶封闭，1∶2 00浓度鼠抗人FAK抗体 4℃条件下孵育24 h。PBS重复洗3次，加HRP标IgG二抗，37℃下杂交1h，PBS重复洗6次，显影定影并检测膜上印迹。

1.2.5 悬浮培养：无水乙醇溶解poly-HEMA（10g/L），于6孔培养皿加3mL poly-HEMA溶解液。待乙醇挥发后，同样方法和剂量加2遍poly-HEMA溶液，PBS清洗处理过的培养皿3遍备用。常规收获贴壁细胞，以含有10%新生牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞。然后每个培养孔中加入约1×106细胞，常规37℃、5%CO2条件下培养16小时。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡：将单细胞悬液加入2mL圆底离心管中离心，弃上清液。加入PBS 1mL离心洗涤1次，然后加入70%乙醇（预冷）5mL，4℃冰箱固定30分钟。上机检测前离心去乙醇，碘化丙啶染色15min。

1.2.7 划痕试验：于6孔板培养皿中常规培养细胞，6小时后待细胞贴壁生长后，200μL灭菌吸样枪头细胞划痕，在倒置显微镜下观察机械划并照相。48小时后，再次将培养皿在倒置显微镜，观察划痕并照相。每次照相在高倍镜下选取5个视野，同时使用测微尺测量划痕间隙的距离。

1.2.8 侵袭实验：于细胞操作台内将50μL 200mg/L的Matrigel加入Transwell小室内，风干后置于细胞操作台内备用。使用前用RPMI1640培养液清洗，选择3孔，每孔分别加入100μL密度为2×106个/mL细胞悬液。将小室侵入24孔板含小牛血清1640培养基中，常规5%CO2、37°C培养箱内培养24h。取出Transwell小室，甲醇固定，龙胆紫染色及中性树脂封片。在光学显微镜下选择5个视野，计算透膜细胞总数。最后以透膜细胞的相对数来表示Tca8113细胞的侵袭能力。

1.2.9 细胞活性检测：收获实验组及对照组的细胞，台盼蓝染色，细胞计数器计算出染色细胞，以此计算出细胞活性率。实验重复3次，取均数进行比较。

1.3 统计学处理 数据处理采用SPASS统计软件,计量指标采用均数±标准差（x¯±s）表示，差异性比较采用t检验和重复测量方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因沉默结果鉴定 激光共聚焦显微镜下观察发现转染外源性质粒后细胞形态发生变化，细胞皱缩，细胞碎片增多。FAK siRNA和NON-siRNA质粒因携带红色荧光标记和绿色荧光标记。成功转染后Tca-FAK组细胞中可见红色荧光表达，Tca-NON中可见绿色荧光表达，表明外源性质粒顺利转染入Tca8113细胞（图1a，b）。免疫细胞化学（图1c）及Western-blot（图1e）结果显示：Tca8113细胞中FAK表达为强阳性，外源性质粒转染后Tca-FAK组FAK表达较转染前明显下降，Tca-NON组细胞中FAK表达无明显变化。表明RNAi成功实现FAK的下调（图 1c，d，e）。

图 1 基因沉默鉴定结果（a、b：400×；c、d：200×）

2.2 FAK基因沉默对舌癌细胞Tca8113增殖和凋亡影响 3组细胞在单层贴壁状态下培养16小时后，细胞活力检测及流式细胞仪结果显示：Tca-FAK及Tca-NON组细胞的活力较Tca8113组细胞有轻微的下降，凋亡片段也有轻微的增加，但各组间数据比较差异无统计学意义，表明FAK基因沉默对舌癌细胞的增殖和凋亡无明显影响。见表1。

表1 FAK基因沉默前后舌癌细胞活性及凋亡分析（x¯±s，%）

图2 FAK基因沉默促进舌癌细胞Tca8113失巢凋亡

2.3 FAK基因沉默对舌癌细胞Tca8113迁移能力影响 细胞化痕实验结果显示：48小时后对照组（Tca-NON）细胞迁移距离为（0.91+0.05）mm，实验组（Tca-FAK）细胞迁移距离为（0.30+0.03）mm，肿瘤细胞迁移能力明显降低（P<0.01），如图3。

为了进一步观察FAK基因沉默对Tca8113失巢凋亡的影响，我们采用polyHEMA培养基剥夺细胞的贴壁培养条件，诱导细胞悬浮生长。不同于贴壁培养状态下细胞的单层生长方式，16小时后，显微镜下观察到，Tca8113细胞及Tca-NON组细胞呈现集聚性生长的方式（图2d，e），但Tca-FAK组细胞并未出现明显的集聚性生长状态（图2f）。流式细胞仪分析细胞凋亡结果显示：Tca-FAK的凋亡片段显著高于对照组及Tca8113组（P<0.01），表明FAK基因沉默可促进舌癌细胞的失巢凋亡（图2g）。

图3 FAK基因沉默对舌癌细胞Tca8113迁移能力的影响

2.4 FAK基因沉默对舌癌细胞Tca8113侵袭能力影响 体外Transwell小室实验结果显示：对照组细胞侵袭透膜数为211.4+5.3个，而FAK基因沉默后的Tca8113细胞，侵袭能力明显下降，仅为64.6+3.0（P<0.01）。见图 4。

图4 FAK基因沉默对舌癌细胞Tca8113侵袭能力影响

3 讨 论

做为一种非受体酪氨酸激酶，粘着斑激酶可通过多种信号分子通路在细胞的运动、迁徙、血管生成等方面发挥重要作用[1-4]。课题组人员前期通过对舌癌原发灶及转移淋巴结的病理分析发现：黏着斑激酶在颊、舌癌等口腔恶性肿瘤中高表达，且主要集中在肿瘤生长前沿区及转移区癌细胞中，与颈淋巴结转移的密切相关[5]。

为了验证FAK在舌癌侵袭转移中作用，初期体外实验中，课题组成功构建针对FAK的靶向RNA（small interfering RNA，siRNA）质粒表达载体，免疫细胞化学及western-blot蛋白印迹检测到舌癌细胞Tca8113中FAK表达明显下调。进一步实验，课题组通过划痕和Transwell小室侵袭试验来观察FAK基因沉默前后舌癌细胞侵袭和迁移能力的变化。实验结果显示FAK基因沉默后，Tca8113细胞的侵袭和迁移能力均得到明显抑制（P<0.01），初步显示FAK信号通路在舌癌细胞侵袭和迁移中的作用。

锚着依赖性生存（anchor-dependent survival）是正常实体组织细胞具有的特点之一，一旦在脱黏附状态下就会发生凋亡，即失巢凋亡（anoikis）。发生转移的癌细胞则具失巢凋亡抗性，即在脱黏附状态下可以一种特殊的形式生存，这也是癌细胞可发生远处转移的生物学机制之一。目前已有学者通过体外实验证实失巢凋亡抗性在口腔癌、胰腺腺癌等的转移中起到关键性的作用[3-4，7-8]。为验证FAK信号通路在舌癌细胞增殖及凋亡中作用，本实验第一阶段在60mm培养皿上，将FAK基因干扰前后的细胞进行单层贴壁培养，细胞活性检测和流式细胞仪分析发现，基因干扰前后舌癌细胞Tca8113的活性及凋亡比较差异均无统计学意义。至于其中轻微的差异，笔者认为可能是基因片段转染入肿瘤细胞后，因负荷增加而导致其活性及凋亡有轻微差异。总结第一阶段实验结果，我们认为单层贴壁培养状态下，FAK信号通路改变对舌癌细胞的增殖和凋亡无明显影响。第二阶段，在相同条件下我们将基因沉默前后的细胞，在poly-HEMA处理过的60mm培养皿上进行相同时间的悬浮培养后，流式细胞仪测量的凋亡结果显示：悬浮培养状态下，FAK基因沉默后，细胞的凋亡率明显增加（P<0.01）。实验中我们有趣的发现，Tca8113细胞及Tca-NON组细胞呈现集聚性生长方式，但Tca-FAK组细胞并未出现这种集聚性生长。参考国内外文献，笔者认为FAK可能激活了包括MAPK、PI3K-Akt/PKB等信号级联反应，因失巢引起的源于细胞外基质的生存信号进而得到补偿。癌细胞因具有失巢生存的能力，可在脱黏附状态下生存，进而发生转移。

综上所述，我们认为FAK基因沉默明显增加Tca8113细胞的失巢凋亡能力，进而逆转癌细胞的失巢凋亡抗性，降低了其侵袭和转移的能力。在进一步的实验中，我们将对FAK下游相关信号通路进行实验分析，探讨其可能的分子途径，以期为口腔癌的治疗提供一种崭新的思路。

[1]Liu MZ，Y ang Y，Wang C，et al.The effect of epidermal growth factor receptor variant IIIon glioma cellmigration by stimulating ERK phosphorylation through the focal adhesion kinase signaling pathway［J］.Arch Biochem Biophys，2010，502（2）：89-95.

[2]Earley S，Plopper GE.Phosphorylation of focal adhesion kinase promotes extravasation of breast cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，366（2）：476-482.

[3]Duxbury MS，Ito H，Zinner MJ,，et al.Focal adhesion kinase gene silencing promotes anoikis and suppressesmetastasis of human pancreatic adenocarcinoma cells［J］.Surgery，2004，135（5）：555-562.

[4]Mclean GW，Carragher NO，Avizienyte E，et al.The role of focal-adhesion kinase in cancer-a new therapeutic opportunity［J］.Nat Rev Cancer，2005，5（7）：505-515.

[5]江宏兵，田卫东，李声伟，等.口腔鳞癌粘着斑激酶表达与颈淋巴结转移的关系［J］.实用口腔医学杂志，2003，19（3）：199-201.

[6]刘华联，江宏兵，邢树忠，等.靶向黏着斑激酶siRNA表达载体构建及转染Tca8113细胞的沉默效应［J］.实用口腔医学杂志，2008，24（1）：13-16.

[7]Paoli P，Giannoni E，Chiarugi P.Anoikismolecular pathways and its role in cancer progression［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1833（12）：3481-3498.

[8]Carduner L，Picot CR，Leroy-Dudal J，et al.Cell cycle arrest or survival signaling throughαv integrins,activation of PKC and ERK1/2 Lead to anoikis resistance of ovarian cancer spheroids［J］.Exp Cell Res，2014，320（2）：329-342.