绿茶浸提液对釉质再矿化作用的体外研究

徐晓南, 方 谦, 彭 伟, 卢淑娟, 翟亚男, 刘庆辉, 王吉天

(华北理工大学口腔医学院, 河北 唐山 063000)

绿茶浸提液对釉质再矿化作用的体外研究

徐晓南, 方 谦, 彭 伟, 卢淑娟, 翟亚男, 刘庆辉, 王吉天

(华北理工大学口腔医学院, 河北 唐山 063000)

目的: 体外观察绿茶浸提液对早期釉质龋的再矿化作用。方法：选择新鲜拔除的牛健康切牙并制备成釉质块，建立人工龋模型后，随机分为绿茶浸提液组、含氟牙膏组(n=5)和去离子水组(n=5)，其中绿茶浸提液分为0.1、0.05、0.03 g/mL 3个浓度组(n=5)，各组均进行再矿化处理；SEM观察再矿化前后釉质表面形态，X射线能谱仪分析釉质表面再矿化前后钙磷比。结果：SEM观察结果显示，随着绿茶浸提液浓度的增加釉质表面的结构更加致密均匀，釉质表面的沉积物较含氟牙膏组更为均匀光滑；能谱仪分析结果显示，各组间钙磷比有统计学差异(P<0.05)；各浓度绿茶浸提液组的钙磷比值均高于含氟牙膏组。结论：绿茶浸提液能够促进脱矿釉质再矿化，其再矿化效果优于普通含氟牙膏。

绿茶浸提液; 釉质; 再矿化; 扫描电镜

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.10.006

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(10): 602]

龋病是在以细菌为主的多因素作用下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病。早期釉质龋主要表现为釉质表层下脱矿、微晶结构改变，临床上可见釉质透明度下降，呈白垩色。对早期釉质龋的治疗主要采用非手术方法，即通过再矿化治疗使脱矿的釉质再次矿化，以恢复其硬度并终止龋损的进一步发展[1]。目前用于再矿化的制剂有氟化物、五倍子和茶多酚等，其中含氟牙膏应用较为广泛，但儿童误吞误咽则会引起急、慢性氟中毒，过量使用也可引起氟牙症、氟骨症[2], 其安全系数有待评价。而茶是世界上三大不含酒精的饮料之一，具有保健作用，近来有研究认为茶可防龋，其防龋的有效成分主要是氟和茶多酚[3-5]。茶多酚具有抑菌作用，且普通绿茶的抑菌作用较好[6]，但茶叶促进早期釉质龋再矿化作用的研究鲜有报道。本实验通过研究绿茶浸提液对脱矿牛牙釉质再矿化的作用，为进一步分析绿茶浸提液的防龋机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

绿茶(漳州天福茶叶); 含氟牙膏(含氟量0.14%)(高露洁，美国)；脱矿液配方[3]: 2.2 mmol/L Ca(NO3)2、2.2 mmol/L KH2PO4、50 mmol/L CH3COOH、5.0 mmol/L NaN3、0.5 mg/L NaF，pH为4.5；人工唾液配方(ISO/TR10271标准)：氯化钠0.4 g、氯化钾0.4 g、无水氯化钙0.795 g、磷酸二氢钠0.78 g、硫化钠0.005 g、尿素1 g、去离子水稀释至1 000 mL，pH为7.0；扫描电镜(日立，日本)；X射线能谱仪(Thermo Fisher，美国)；高速硬组织切割机(Struers，丹麦)；体视显微镜(徕卡，德国)；电热恒温培养箱(北京科伟永兴)。

1.2 标本的选择和制备

选择新鲜拔除的无龋损、无釉质发育不全、无裂痕的牛切牙35个，去除根部软组织，清洗消毒后4 ℃保存备用。用碳化硅砂纸在去离子水流下抛光唇面，硬组织片切轮将冠部切成4 mm×4 mm×2 mm的釉质块35个，除唇侧釉质面外均涂上双层抗酸指甲油。随机选出5个标本作为正常对照组进行扫描电镜观察。

1.3 方法

1.3.1 釉质龋模型的建立

将预备好的30个标本放入盛有脱矿液的玻璃瓶中，釉质表面面积与溶液的比率为2 mm2·mL-1，在37 ℃恒温箱中持续浸泡3 d，每天换新鲜脱矿液，釉质面呈明显白垩色即人工龋模型建立成功。随机抽取5个标本作为脱矿对照组，观察脱矿后釉质块表面形态结构的改变及测量钙磷比值。

其余25个脱矿釉质标本随机分为3个实验组，A组：绿茶浸提液组(n=15)；B组：含氟牙膏组(n=5)；C组：去离子水组(n=5)。绿茶浸提液组按浓度梯度分为A1 、A2 、A3小组，浓度分别为0.1、0.05、0.03 g/mL(n=5)。

1.3.2 绿茶浸提液和含氟牙膏液的配置

绿茶浸提液：称取16、8、10 g茶叶并捣碎，分别加入160、160、300 mL的去离子水煮沸15 min，用200目尼龙布过滤，沉淀后取滤液，沉淀部分再按上述同样的方法连续提取2次并取滤液，将每次所得滤液分别各自集中在一起即浓度为0.1、0.05、0.03 g/mL的浸提液。

含氟牙膏液：称4 g牙膏加入40 mL去离子水中，快速单方向搅拌至完全溶解，静置取上清液,即浓度为0.1 g/mL的含氟牙膏液。

1.3.3 再矿化处理

将各实验组标本分别放入相应处理液中浸泡,2次/d(早、晚各1次，1 h/次)，共处理10 d。然后去离子水冲洗其表面1 min，浸泡于人工唾液中(去离子水组除外)，置于37 ℃电热恒温培养箱。

1.3.4 SEM观察釉质表面形态结构的改变

将各组釉质块固定在SEM载物台上，抽真空喷金，观察正常釉质及各组再矿化前后的釉质表面形态(20 kV、×1 000)。

1.3.5 能谱分析仪分析釉质表面的元素

在各样本的观察界面上随机选取3个点，用X射线能谱分析仪进行点扫描，分析釉质表面的元素含量，并计算钙磷比值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行数据输入和分析，各组间钙磷比值的比较选用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肉眼观察

釉质块样本脱矿后釉质表面粗糙，失去光泽，呈白垩色。再矿化液处理后，绿茶浸提液组釉质表面为棕黄色; 去离子水和含氟牙膏组釉质表面未见着色，其中含氟牙膏组釉质表面白垩色改变减轻。

2.2 釉质脱矿和再矿化后的SEM观察结果

正常釉质表面光滑、均一(图1a)，脱矿后可见釉质表面呈蜂窝状改变，釉柱中心溶解，部分釉柱间质破坏，大部分出现孔隙样凹陷(图1b)。去离子水组釉质表面仍有大量蜂窝状空隙，少量空隙有碎屑沉积(图1c)。经不同浓度绿茶浸提液处理后的釉质表面可见排列凌乱的球形微粒沉积，未见蜂窝状凹陷，绿茶浸提液浓度越高，则微粒数量越多，排列越密实均匀(图d～f)。含氟牙膏组釉质表面粗糙，其表面沉积的颗粒较大，形状不规则(图1g)。

a.正常釉质b.脱矿釉质c.去离子水组d.0.1g/mL绿茶浸提液组

e.0.05g/mL绿茶浸提液组 f.0.03g/mL绿茶浸提液组 g.含氟牙膏组

图1 各组釉质表面形态的观察(SEM，×1 000)

2.3 X射线能谱仪分析结果

单因素方差分析显示，各组标本分别经含氟牙膏、绿茶浸提液、去离子水处理后，釉质表面钙磷比差异显著(F=1641.089，P=0.000)；两两比较显示，除去离子水组与脱矿组的钙磷比值差异无统计学差异(P=1.000)外，其他各组间钙磷比均具有统计学差异(P=0.000)，其中0.1 g/mL的绿茶浸提液组的钙磷比值最高(表1)。

表1 脱矿釉质经不同处理液处理后钙磷比的比较 ±s)

*与脱矿组相比P﹥0.05

3 讨论

人工致龋的方法分为口内法、化学致龋法、电化学法、细菌产酸致龋法和人工口腔模型。本实验采用的是化学致龋法，即先用脱矿液使釉质脱矿，再采用pH循环法模拟人的口腔环境来进行再矿化处理，模拟了龋病的主要发生发展过程，对绿茶浸提液促进早期釉质龋再矿化的研究有一定的意义。早期釉质龋的临床表现为牙齿表面出现白垩色不透明斑点，且牙体表面外形仍完整[7]。本实验中牛牙釉质块经脱矿液处理后均成白垩色，提示早期釉质龋的形成。

本结果显示，随着绿茶浸提液浓度的增加，脱矿釉质块表面结构越致密均匀，且釉质表面的钙磷比值随之增高。提示，高浓度的绿茶浸提液促进脱矿釉质再矿化的效果较低浓度的好，这可能与茶叶中所含的氟离子有关。茶叶释放的氟离子部分粘附在牙齿表面的菌斑内，从而抑制致龋细菌的生长和代谢；部分氟离子通过釉质的微孔结构进入釉质内部，取代羟基磷灰石形成氟磷灰石，从而增强釉质抗酸蚀的能力；氟离子可与唾液及釉质溶解产生的钙离子结合，形成氟化钙沉积层，其遇酸可缓慢溶解、释放氟离子[8]。由图1d可见，釉质块经高浓度绿茶浸提液处理后，其釉质表面分布的大小均匀致密的球状颗粒可能为氟化钙，这一形态特点与Petzold[9]报道的氟化釉质表面的沉积物呈球形相符合。

对釉质表面的成分分析可采用电子探针显微分析仪、原子光谱分析法、电子能谱分析法和分子光谱分析法等。而在釉质的再矿化实验中常用X线能谱量化表面钙、磷的相对含量，从而评估再矿化结果[10]。釉质发育不全的牙面钙离子含量较正常牙低，其抗酸溶解能力也随之下降。有学者发现，釉质发育不全与龋损的发生具有显著相关性，从而推测釉质发育不全者更易患龋病[11]。本实验在体外pH循环下进行，标本在脱矿液中浸泡的时间相对较长，最后形成的Ca/P比值也较高。提示，釉质表面经过高浓度的绿茶浸提液处理后，其抗酸能力增强，对釉质具有保护作用， 与黎淑芳等[12]研究结果相一致。本结果显示，在相同浓度下，绿茶浸提液组的钙磷比值高于含氟牙膏组，且釉质表面的沉积物更为均匀光滑，说明绿茶浸提液促进脱矿釉质再矿化效果优于含氟牙膏。虽然绿茶能治疗早期釉质龋，但其能使牙面着色，且随茶浓度的增加而加深。因此可选用低色素或低浓度的绿茶，及时清洁口腔，避免牙齿着色。

绿茶的成分较为复杂，含有酚类、蛋白质、芳香物质、生物碱、维生素与色素类、矿物质、微量元素等。但目前认为其主要防龋活性成分为氟和茶多酚。茶多酚为茶叶的重要组成部分，占25%，其作用是抑制致龋菌的生长发育，抑制变异链球菌的粘附和聚集，进而控制菌斑[13]。刘鑫等[14]发现绿茶的pH高于脱矿临界值，对牛牙釉质的脱矿程度较其他种类茶及人工唾液小。有研究发现，多形性茶多酚与氟混合处理牙面可促进钙盐沉积，从而提高釉质的抗酸能力[15]；而李继遥等[16]认为茶多酚对釉质脱矿和再矿化无明显的抑制或促进作用, 同氟亦无协同作用，其抗龋作用是通过抗菌和抗菌斑作用实现的。本结果显示，绿茶能够促进脱矿釉质再矿化。而绿茶的防治龋的机制可能与氟离子的抗龋机制相关，也可能是茶多酚与氟的协同作用，有待进一步的验证。

[1]樊明文,周学东.牙体牙髓病学[M]. 4版 . 北京: 人民卫生出版社, 2014:3-68.

[2]Aoba T. Solubility properties of human tooth mineral and pathogenesis of dental caries[J].OralDis, 2004,10(5):249-257.

[3]刘晓丹，石四箴.茶多酚防龋研究进展[J]. 上海医学, 2005,28(9)：813-814.

[4]高京，王勤，乐嗣勋，等. 茶叶的防龋与再矿化作用研究[J]. 北京医科大学学报, 1994,26(2)：132-133.

[5]黎淑芳, 陆海峰, 邓敏, 等. 茶浸出液对牙釉质抗酸性的影响[J]. 右江民族医学院学报, 2014,2:238-239.

[6]任蕾,杨圣辉,果梅英.六种茶叶对口腔常见致病菌的抑菌作用[J]. 北京口腔, 2003,11(2):91-93.

[7]周学东,梁景平.龋病学[M]. 北京:人民卫生出版社, 2011:96-97.

[8]孙皎,赵信义.口腔生物材料学[M]. 北京:人民卫生出版社, 2011:127-132.

[9]Petzold M.The influence of different fluoride compounds and treatment conditions on dental ename:A descriptive in vitro study of the CaF2 precipitation and microstructure[J].CariesRes, 2001,35(1):45-51.

[10]Lou L,Nelson AE,Heo G,etal. Surface chemical composition of human maxillary first premolar as assessed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS)[J].ApplSurfSci, 2008,254: 6706-6709.

[11]郑树国,邓辉,高学军,等.发育不全乳牙釉质的化学成分和晶体结构的初步研究[J]. 中华口腔医学杂志,1997,32(6):366-368.

[12]黎淑芳,陆海峰,邓敏,等.茶浸出液对牙釉质抗酸性的影响[J]. 右江民族医学院学报, 2014,2:238-239.

[13]蒋纯荣,林凯烨,章和平.茶叶防龋的研究与应用[J]. 广东牙病防治, 2001,9(1):64-65.

[14]刘鑫,谭理军,李涛,等.不同种类茶对牛牙的釉质脱矿影响的体外初步研究[J]. 国际口腔医学杂志, 2013,40(6):710-713.

[15]Sabb ak SA, Has sanin MB. A scanning electron microscopic study of tooth surface changes induced by tannic acid[J].JProsthetDent,1998;79(2):169.

[16]李继遥,詹玲, Barlow J, 等. 茶多酚致釉质脱矿与再矿化的初步研究[J]. 四川大学学报(医学版), 2004, 35(3):364-366.

The effects of green tea water extracts on the remineralization of enamel: an in vitro study

XU Xiao- nan, FANG Qian, PENG Wei, LU Shu- juan, ZHAI Ya- nan, LIU Qing- hui,WANG Ji- tian

(CollegeofStomatology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

AIM: To investigate the remineralization effect of green tea water extracts on early enamel caries. METHODS: Enamel blocks were made from freshly extracted bovine teeth and were demineralized in deminaralizing solution to establish early enamel caries. The blocks were treated by different green tea extracts at 0.1, 0.05 and 0.03 g/mL, fluoride toothpaste and distilled deionized water for 1 h respectively(n=5). Afterwards, the blocks were incubated in artificial saliva for 10 d. The Surface morphology of the samples was observed by scanning electron microscopy. Calcium and phosphorus contents were examined by X- ray energy spectrum analysis. RESULTS: The enamel surface structure in green tea extract groups was more compact and uniform. Green tea extracts dose- dependently increased the ratio of calcium and phosphorus in the enamel. X- ray energy spectrum analysis showed that green tea extract groups had significantly higher calcium/phosphorus ratio than the fluoride tooth paste group and distilled deionized water group (P<0.05). CONCLUSION: Green tea extracts have stronger remineralizing effects on demineralized enamel than fluoride toothpaste.

green tea extracts; enamel; remineralization; SEM

2015-04-27;

2015-08-12

国家大学生创新训练项目(201310081011)

徐晓南(1992-),女,汉族, 河北人。本科生(指导老师：彭伟)

彭 伟，E-mail:pengwei1968@sina.com

R780.1

A

1005-2593(2015)10-0602-04