Bcl- 2及DPC4在牙龈癌中的表达及相关性研究

张 强, 刘继刚, 刘 江, 刘 昊

(1. 华北理工大学附属医院, 河北 唐山 063000; 2. 遵化市人民医院口腔科, 河北 遵化064200) 3. 华北理工大学基础医学院, 河北 唐山 063000)

Bcl- 2及DPC4在牙龈癌中的表达及相关性研究

张 强1, 刘继刚2, 刘 江3, 刘 昊1

(1. 华北理工大学附属医院, 河北 唐山 063000; 2. 遵化市人民医院口腔科, 河北 遵化064200) 3. 华北理工大学基础医学院, 河北 唐山 063000)

目的: 观察Bcl- 2、DPC4蛋白在不同分化类型牙龈癌中的表达情况。方法：取手术切除的牙龈癌组织石蜡标本33例(其中高分化15例、中分化10例、低分化8例)，以及术中随机从癌旁切除的正常牙龈组织石蜡标本8例为检测对象；分别制备组织切片后，免疫组化技术检测各标本组织中Bcl- 2、DPC4蛋白的表达情况。结果：①在正常牙龈组织以及高、中、低分化的牙龈癌组织中，Bcl- 2蛋白的阳性表达率(%)分别为12.50、53.33、60.00、100，DPC4蛋白的阳性表达率(%)分别为87.25、53.33、50.00、12.50(P<0.05)；②在正常牙龈组织以及高、中、低分化牙龈癌组织中，Bcl- 2蛋白的表达水平(IOD值)分别为1.86±0.33、4.55±1.23、9.60±0.92、13.92±1.84(P<0.05)，DPC4蛋白的表达水平分别为19.64±0.72、13.47±1.20、9.33±1.00、2.42±0.72(P<0.05)；③Bcl- 2、DPC4蛋白表达变化在牙龈癌中呈负相关(r=-0.929,P<0.05)。结论：牙龈癌组织中Bcl- 2蛋白表达增高，DPC4蛋白表达降低，二者具有相关性。

B淋巴细胞瘤-2基因; 胰腺癌缺失基因; 牙龈癌; 免疫组织化学

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.10.002

[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2015, 25(10): 584]

牙龈癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，有较高的发病率、转移率和复发率，且绝大多数为高分化的鳞状上皮细胞癌[1-2]。研究与牙龈癌发生、转移、预后相关的生物学指标将有助于综合性方法的合理应用，以提高患者的生存率及生存质量。牙龈癌是多因素、多基因、多阶段共同作用的结果，主要包括多种癌变基因的激活及抑癌基因的失活、缺失。Bcl- 2是一种从滤泡型B细胞淋巴瘤中分离出来的基因，其主要功能与细胞的程序性凋亡有关，是凋亡调控基因之一[3-4]。DPC4(deleted in pancreatic cancer4, DCP4)是在胰腺癌中发现的一种新型肿瘤抑制基因，其主要功能为调节细胞的生长、分化和凋亡[5]。本实验旨在观察Bcl- 2蛋白和DPC4蛋白在不同类型牙龈癌中的表达、分布及变化情况，并进一步分析两者与牙龈癌分化程度的关系, 以期为临床早期诊断及制定合理的治疗方案提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂

牙龈癌组织石蜡标本来自华北理工大学附属医院口腔颌面外科，共33例，其中高分化15例、中分化10例、低分化8例；正常牙龈组织石蜡标本8例，为手术中随机从癌旁切取的正常牙龈组织；鼠抗DPC4多克隆抗体、兔抗Bcl- 2多克隆抗体(武汉博士德)；免疫组化试剂盒(北京中杉金桥)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化方法

分别取上述33例牙龈癌及8例正常牙龈组织石蜡标本，常规制备组织切片后，进行免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡至水，用30 mL/L过氧化氢液室温下封闭其内源性过氧化物酶活性后，分别进行抗原热修复和50 g/L BSA封闭；然后分别滴加DPC4和Bcl- 2一抗(浓度均为1 ∶150)并4 ℃孵育过夜；生物素化标记IgG并37 ℃孵育20 min后，DAB显色、常规封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.2 结果判定及定量分析

在高倍镜(×400)下分别从每张切片中各选取5个不同视野进行观察，并按以下标准判定染色阳性结果：Bcl- 2以细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达；DPC4以细胞胞浆和(或)细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达。根据空白和阳性对照的显色情况，确定无假阳性和假阴性后，用 Image-Pro- plus 6.0图像分析软件系统对各切片阳性细胞表达的光密度进行定量分析，并以其积分光密度(IOD)代表染色强度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组Bcl- 2、DPC4的阳性表达情况

免疫组化染色结果显示：Bcl- 2主要表达于细胞浆内和细胞膜上，呈棕黄色着色(图1a～d)；DPC4主要表达于细胞浆和细胞核内，呈棕黄色、弥散分布(图1e～h)。Bcl- 2、DPC4在正常牙龈组织和不同分化程度牙龈癌组织中的阳性表达率见表1：其中Bcl- 2在正常牙龈组织中的阳性表达率最低(12.50%)，与正常组相比，其在牙龈癌组织中的阳性表达率则明显升高，且随着分化程度的降低而越来越高，各组间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)；DPC4在正常牙龈组织中的阳性表达率最高(87.50%)，与正常组相比，其在牙龈癌组织中的阳性表达率则明显降低，且随着分化程度的降低而越来越低，各组间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 Bcl- 2、DPC4在正常牙龈和不同分化 牙龈癌组织中的阳性表达率比较 (例, %)

不同字母组间P<0.05

正常牙龈组织 高分化牙龈癌组织 中分化牙龈癌组织 低分化牙龈癌组织

图1 Bcl- 2和DPC4免疫组化染色结果(SABC，×400)

2.2 各组Bcl- 2和DPC4表达水平(IOD)的比较

Bcl- 2在正常牙龈组织的IOD值表达量最低; 与正常牙龈组织相比，其在牙龈癌组织中的IOD值表达量明显增高，且随着分化程度降低而越来越高，各组间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)。DPC4在正常牙龈组织中的IOD值表达量最高; 与正常牙龈组织相比，其在牙龈癌组织中的表达量明显降低，且随着分化程度的降低而越来越低，各组间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)。相关性分析结果显示，Bcl- 2和DPC4在不同分化类型牙龈癌中的表达呈明显负相关(r=-0.929，P<0.05)。

表2 各组Bcl- 2和DPC4表达水平(IOD值)的比较

不同字母组间P<0.05

3 讨论

牙龈癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，目前仍以手术切除为主。但手术治疗会造成患者颜面部的缺损和畸形，从而给患者的生理和心理带来不利影响。因此研究与牙龈癌的发生、转移、预后相关的生物学指标将有助于探讨其新的综合性治疗方法。虽然有关肿瘤的分子生物学行为机制目前尚不清楚，但已知肿瘤组织内会由于细胞凋亡和增殖失衡而出现细胞凋亡的现象[6]。细胞凋亡是一种自稳态机制，可通过抑制过度生长的细胞群体从而对肿瘤产生负作用。有研究表明，Bcl- 2蛋白产物在人体细胞中的表达量与细胞生存时间的长短有着密切关系[7]。DPC4编码的Samad4蛋白是TGF- β信号传导途径的中心分子，而TGF- β则是一种具有调节细胞生长、增殖、分化、凋亡等多种生理功能的细胞因子，不仅能通过下调p53基因导致编码蛋白的表达减少，同时还能抑制细胞生长周期过渡到G1/S期，并引发细胞DNA损伤，从而导致细胞凋亡[8]。目前关于Bcl- 2和DPC4在牙龈癌中的表达及其与牙龈癌的关系尚未见相关研究报道。

本结果显示，在正常牙龈组织中，Bcl- 2的表达较低，而DPC4的表达则较高。在牙龈癌组织中，Bcl- 2的表达较正常组明显增高，且随着分化程度的降低而越来越高；而DPC4的表达则较正常组明显降低，且随着分化程度的降低而越来越低。以上结果表明，牙龈癌的恶性程度越高，Bcl- 2的表达越高，而DPC4的表达则越低。相关性分析结果显示，Bcl- 2和DPC4在不同分化类型牙龈癌中的表达呈明显负相关；提示，两者在牙龈癌的发生、发展中发挥协同作用。

综上所述，DPC4基因在牙龈癌中的表达明显减少，而Bcl- 2的表达则明显增高，说明两者在牙龈癌的发生、发展中均起着重要作用，有可能成为牙龈癌的诊断、分型、治疗以及愈后判断的指标之一。

[1]张诠. 116例牙龈癌的治疗与预后分析[J]. 癌症, 2008, 27(3): 307-310.

[2]柳杨. 口腔白斑中抑癌基因启动子高甲基化的研究[D]. 上海: 上海交通大学, 2011.

[3]林良缘, 高洋, 柯学平, 等. 表皮生长因子受体与口腔白斑癌变关系的初步研究[J]. 口腔医学, 2010, 30(4): 199-201.

[4]张素欣. PTEN在口腔鳞状细胞癌中的定量分析及平阳霉素化疗对其表达的影响[J]. 现代口腔医学杂志, 2006, 20(1): 9-10.

[5]Hahn SA, Schutte M, Hoque AT,etal. DPC4, a candidate tumor suppress or gene at human chromosome 18q21.1[J].Science, 1996, 271(5247):350-353.

[6]Daniel FI, Rivero ER, Modolo F,etal. Immunohistochemical expression of DNA methyltransferases 1, 3a and 3b in oral leukoplakias and squamous cell carcinomas[J].ArchOralBiol, 2010, 55(12): 1024-1030.

[7]Ortholan C, Lusinchi A, Italiano A,etal. Oral cavity squamous cell carcinoma in 260 patients aged 80years or more[J].Radiotheroncol, 2009, 93(3): 516-523.

[8]Krishnan MMR, Chakraborty C, Paul RR,etal. Hybrid segmentation, characterization and classification of basal cell nuclei from histopathological images of normal oral mucosa and oral submucous fibrosis[J].ExpertSystemswithApplication, 2012, 39(1): 1062-1077.

Expression and relationship of Bcl-2 and DPC4 in Gingival Cancer

ZHANG Qiang*, LIU Ji- gang, LIU Jiang, LIU Hao

(*DepartmentofDentistry,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofSciencesandTechnology,Tangshan063000,China)

AIM: To investigate the expression of Bcl- 2 and DPC4 in gingival cancer tissues . METHODS: 33 paraffin specimens of gingival cancer tissues (15 well- differentiated,10 moderately differentiated and 8 poorly differentiated) and 8 cases of normal gingival tissues were examined. The expression of Bcl- 2 and DPC4 in the samples was detected by immunohistochemistry method. RESULTS：Positive expression rates of Bcl- 2 in normal gingival tissue, well-, moderately- and poorly- differentiated gingival cancer tissues were 12.50%, 53.33%, 60.00% and 100% respectively(P<0.05); while positive DPC4 expression rates were 87.25%, 53.33%, 50.00% and 12.50% respectively(P<0.05). The IOD value of Bcl- 2 in normal gingival tissue, well-, moderately- and poorly- differentiated gingival cancer tissues were 1.84±0.33, 4.55±1.23, 9.60±0.92 and 13.92±1.84 respectively(P<0.05); whereas, the IOD value of DPC4 were 19.64±0.72, 13.47±1.20, 9.33±1.00 and 2.42±0.72 respectively(P<0.05). Bcl- 2 and DPC4 expressions in gingival cancer tissues were negatively correlated(r=-0.929，P<0.05). CONCLUSION: In gingival cancer tissues, Bcl- 2 expression increases, while DPC4 expression decreases. The expression of Bcl- 2 and DPC4 is negatively related.

Bcell lymphoma- 2 (Bcl- 2) ; deleted in pancreatic cancer 4 (DPC- 4); gingival cancer; immunohistochemistry

2015-07-06

国家自然科学基金(81201048)

张 强(1975-)，男，汉族，河北唐山人。硕士，副主任医师

刘 昊, E-mail：liuhao938@163.com

R780.2

A

1005-2593(2015)10-0584-04

河北省医学科学研究重点课题(20150087)