小麦蛋白酶水解制备面包风味前体物质的研究

顾沁，吕萍，黄武宁，张印，吴凤凤，张延杰，徐学明*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214112；2.义乌市海之纳生物工程有限公司，浙江义乌322000；3.广东中山市咀香园食品有限公司，广东中山 528437）

小麦蛋白酶水解制备面包风味前体物质的研究

顾沁1，吕萍1，黄武宁2，张印1，吴凤凤1，张延杰3，徐学明*1

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214112；2.义乌市海之纳生物工程有限公司，浙江义乌322000；3.广东中山市咀香园食品有限公司，广东中山 528437）

以水解度和感官评定为指标，研究风味蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶对小麦蛋白的水解作用和美拉德产物风味的影响。结果表明，风味蛋白酶最合适用于制备面包风味前体物质。通过正交实验确定最佳水解条件，采用底物质量分数5%，pH 7.0，风味蛋白酶加酶量2 000 U/g，在50℃酶解2.5 h，所得酶解产物为最佳面包风味前体物质，得到的水解度为35.50%。分析不同时间酶解液中氨基酸和相对分子质量对美拉德产物影响，发现水解2.5 h面包风味前体物质中对面包风味形成起贡献的氨基酸质量浓度分别比0.5 h和1.5 h的酶解液多5.24 mg/mL和3.91 mg/mL，总游离氨基酸的质量浓度分别多7.42 mg/mL和4.45 mg/mL，具有更高美拉德反应程度的肽相对分子质量小于3 861的占比分别增加6.79%和1.59%，尤其是相对分子质量小于1 405占比分别增加12.34%和3.34%。SPME/GC-MS分析结果表明：面包风味前体物质制备得到的美拉德产物具有面包焙烤特征风味。

小麦蛋白；风味蛋白酶；水解度；美拉德产物

水解植物蛋白是一种广泛应用的食品风味前体物质，它是由大豆蛋白、小麦蛋白等蛋白资源经过水解得到的。酶法水解植物蛋白（enzymatically hydrolyzed vegetable protein）是利用蛋白酶对植物蛋白进行水解。与传统的利用4～6 mol/L的盐酸在100～130℃温度下水解4～24 h［1］的酸水解方法相比，酶法水解反应条件温和并且得到的酶解液风味更柔和、颜色更明亮［2］。此外，更重要的优势在于酶法水解的产物是氨基酸和肽，没有酸水解产生的致癌物质3-氯-1，2-丙二醇和1，3-二氯-2-丙醇［3］，符合食品安全性的要求。

面包是西方国家的主食，由于其具有营养、携带和食用方便等特点，在我国也越来越受消费者喜爱。风味对面包品质起着十分重要的作用，它是吸引消费者购买和促进其食欲的首要因素，某种程度上决定着面包的销售价格。面包中已经鉴定出超过540种风味物质，主要是醇类、酯类、醛类、酮类、酸类、烃类和杂环类包括呋喃、吡嗪、吡啶和吡咯啉等［4］。其中，面包表皮风味物质主要是通过焙烤过程中氨基酸与还原糖发生的美拉德反应形成。为了改善面包的风味，已有的方法包括选用特殊的菌种［5］，如产香酵母菌和乳酸菌，或在配方中添加较多的奶制品等天然风味物质外，更多的是采用既经济又使用方便的食用香精香料。但这些添加剂的使用，除了在面包风味的自然性方面有欠缺外，还常使消费者具有安全性的顾虑。因此，开发风味更自然的天然风味物质对提高面包品质十分重要。作者拟采用酶法水解小麦蛋白（面筋）的方法，制备面包风味前体物质——小麦蛋白酶解产物，得到了风味良好的美拉德产物，初步探究了美拉德反应型面包风味物质的制备。

1 材料与方法

1.1 实验与仪器

小麦蛋白（谷朊粉）：南通联海维景生物有限公司产品；风味蛋白酶（Flavourzyme）、复合蛋白酶（Protamex）：Sigma-Aldrich公司产品；中性蛋白酶（Neutrase）：江苏锐阳生物科技有限公司产品。

AB104-N型电子分析天平、FiveEasy pH计：梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司产品；HZS-H型超级水浴恒温振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；RJ-TDL-50A型低速台式大容量离心机：无锡瑞江分析仪器有限公司产品；C-MAG.HS7型加热磁力搅拌器：IKA公司产品；HWS24型电热恒温水浴锅、DHG-9140A型电热鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司产品；LNK-872型多功能快速消化器、HDK-4型恒温定时控制仪：新宇科教仪器研究所产品；L-8900型日立氨基酸自动分析仪：日本日立公司产品；Waters 600型高效液相色谱仪：沃特世科技有限公司产品；Trace MS气相色谱-质谱联用仪：美国Finnigan公司产品；固相微萃取装置、75 μm CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 小麦蛋白的酶解取一定量的小麦蛋白并加入适量去离子水，配成一定底物质量分数的分散悬浮液。搅拌30 min后用1 mol/L的NaOH调节酶的初始酶解pH。然后加入一定量的酶，置于恒温水浴振荡器开始酶解。水解结束后，酶解液在100℃条件下灭酶10 min，迅速冷却至室温。5 000 r/mim离心20 min后得到酶解上清液。

1.2.2 水解度（DH）的测定采用甲醛固定法测定酶解液中的-NH2含量，根据凯式定氮法（GB 5009.5—2010）测定酶解液中的蛋白质含量，代入下式求得水解度［6］。

式中：h为水解后每克蛋白被裂解的肽键毫摩尔数（mmol/g），htot为每克原料蛋白的肽键毫摩尔数（mmol/g），对于小麦蛋白，htot=8.38 mmol/g。

1.2.3 小麦蛋白酶解液的氨基酸成分测定采用日立氨基酸自动分析仪对氨基酸成分进行测定［7］。氨基酸的检测条件；安捷伦液相色谱仪，ODS HYPERSIL 250 mm×4.6 mm色谱柱，柱温：40℃，流量：1.0 mL/min，流动相A：乙酸钠（pH 7.20），流动相B∶V（乙酸钠）∶V（乙腈）∶V（甲醇）=1∶2∶2，紫外检测器：338 nm、262 nm（Pro，Hypro）。

1.2.4 小麦蛋白酶解液的相对分子质量分布采用高效液相色谱法［8］。Waters 600高效液相色谱仪（配2 487紫外检测器和Empower工作站），TSKgel 2 000 SWXL（300×7.8）mm色谱柱，柱温：30℃，流量：0.5 mL/min，流动相：V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=45∶55∶0.1，紫外检测器：220 nm。

1.2.5 小麦蛋白酶解液制备美拉德产物取不同水解时间的小麦蛋白酶解液100 mL、葡萄糖0.4 mol/L于烧杯中混合均匀，置于25 mL的具塞试管中，塞上塞子后放入120℃烤箱中加热反应40 min。反应结束后，将美拉德产物迅速冷却并于4℃冰箱中保存待分析。

1.2.6 美拉德产物的感官评价由5位有感官评定经验的评定人员从焦香味、糊味、面包特征香气和整体可接受性4个方面对美拉德产物进行感官评定。焦香味、糊味、面包特征香气和整体可接受性所占的权重分别是20%、20%、30%和30%，感官评分取加权平均数，总分9分。感官评分标准见表1。

1.2.7 美拉德产物挥发性成分的检测将美拉德产物放入SPME样品瓶中，样品瓶放入60℃恒温水浴中，然后将老化好的萃取头插入样品瓶的上部，顶空萃取40min，用手柄使纤维头退回到针头内，拔出针头取样。

色谱条件：DB-5MS毛细管色谱柱（30m×0.25mm，0.25 μm）。柱温：起始温度40℃保留2 min，5℃/min升温至60℃，再以3℃/min至100℃，再以15℃/min至240℃，保留10min。载气：He，柱流量：1mL/min。

质谱条件：电离方式EI，进样孔温度250℃，离子源温度200℃，接口温度250℃，电子能量70 eV，灯丝发射电流50 μA，采集方式为全扫描，采集质量范围为m/z 33～450。

GC-MS图谱经计算机和人工检索把每个峰同时与NIST Library和Wiley Library相匹配检索定性，匹配度和纯度大于900作为鉴定结果。化合物定量：按峰面积归一化法计算面积分数。

表1 美拉德产物的感官评分标准Table1Criteria for sensory evaluation of maillard reaction products

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶的选择

风味蛋白酶、复合蛋白酶和中性蛋白酶在其理论的最适条件下（表2）分别对小麦蛋白进行酶水解，得到水解进程曲线。从图1中可以比较出3种蛋白酶对小麦蛋白的水解作用。结果发现，风味蛋白酶的酶解速度最快，并且水解度显著高于其它两种蛋白酶。这可能与不同酶作用的特异性差异相关。风味蛋白酶来源于米曲霉，除了有内切酶的作用，还有在外切酶的作用下，得到高水解度的短肽和游离氨基酸，并且水解后能降低含疏水性氨基酸残基或含脯氨酸残基的肽而引起苦味［9］。从图1中风味蛋白酶的水解进程曲线可以看出，风味蛋白酶在前2.5 h的水解度呈现明显的上升趋势，到达2.5 h后水解趋于稳定，水解度增加不明显。对3种蛋白酶2.5 h的酶解产物制备的美拉德产物感官评定后，发现风味蛋白酶对应的美拉德产物在风味方面具有浓郁的焦香味（表3），而中性蛋白酶和复合蛋白酶对应的美拉德产物焦香味比较淡薄。综上考虑，选用风味蛋白酶来制备面包风味前体物质，初步选择2.5 h作为酶解时间。

表2 几种蛋白酶的最适温度和pHTable2Optimum pH and temperature of proteases

图1 几种蛋白酶水解小麦蛋白的水解进程曲线Fig.1Hydrolysis time curves of wheat protein hydrolyzed by different proteases

表3 几种蛋白酶美拉德产物的感官评定结果Table3Results of sensory evaluation of maillard reaction products by different proteases

2.2 Flavourzyme水解小麦蛋白最佳条件的确定

2.2.1 加酶量对水解度的影响根据预备实验确定的基本条件，考察了加酶量对水解度的影响，结果如图2所示。由图可知，随着加酶量的增大，风味蛋白酶水解后的水解度不断上升。当加酶量达到2 000 U/g后，随着加酶量的继续增加，水解度趋于平缓。加酶量的增加可以增大水解程度，提高小麦蛋白底物的利用率，但加酶量太大会增大经济成本，所以确定风味蛋白酶的加酶量为2 000 U/g。

图2 加酶量对水解度的影响Fig.2Effect of Flavourzyme concentration on the hydrolysis degree

2.2.2 小麦蛋白酶解的正交实验结果为了得到较高的水解度，确定风味蛋白酶水解小麦蛋白的最佳条件，根据预备实验结果选取酶解时间、酶解温度、pH和底物质量分数4个因素中3个较优水平，设计L9（34）4因素3水平正交试验。正交试验的因素水平表和结果见表4和表5。

表4 小麦蛋白酶解的L9（34）正交试验的因素水平表Table 4Factors and levels of the orthogonal experiment

表5 小麦蛋白酶解的L9（34）正交试验结果Table 5Analysis of the orthogonal experiment

从表5中极差分析可以看出，D因素即底物质量分数对水解度的影响最大，然后依次为B因素即酶解温度、A因素即酶解时间和C因素即pH。因此，风味蛋白酶水解小麦蛋白的最佳工艺条件为A2B2C2D2，即酶解时间2.5 h，酶解温度50℃，pH 7.0，底物质量分数5%。按此酶解条件对小麦蛋白进行水解，水解实验的水解度为35.50%，与正交实验中的最高水解度33.52%相比，增加了1.98%，说明正交实验得出的最佳水解条件是可行的。

2.3 不同水解时间美拉德产物的感官评价

从焦香味、糊味、面包特征香气和整体可接受性4个方面对不同水解时间小麦蛋白酶解产物制备的美拉德产物进行感官评价。图3显示，水解2.5 h的美拉德产物感官评分最高，即水解2.5 h的酶解产物是最佳面包风味前体物质。水解0.5 h和1.5 h的美拉德产物没有糊味，但焦香味不足；水解2.5 h和3.5 h的美拉德产物焦香味浓郁；3.5 h的美拉德产物比2.5 h的美拉德产物的糊味明显增加、焦香味没有显著增加。

图3 不同水解时间美拉德产物的感官评价结果Fig.3Result of sensory evaluation of maillard reaction products by different hydrolysis time

2.4 酶解液中氨基酸对美拉德产物的影响

未水解小麦蛋白与不同水解时间小麦蛋白酶解液的氨基酸组成见表6。由表可见，小麦蛋白原料中含有大量的谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸，分别占39.17%、11.07%、6.89%、5.86%，占总氨基酸质量分数的62.99%。小麦蛋白酶解液中氨基酸的种类和质量分数对美拉德反应的风味形成有重要影响。与0.5 h和1.5 h的酶解液相比，最佳面包风味前体物质中脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺等5种主要对面包风味形成起贡献的氨基酸质量浓度分别增加5.24 mg/mL和3.91 mg/mL，总游离氨基酸的质量浓度分别增加7.42 mg/mL和4.45 mg/mL，美拉德产物焦香味和面包特征香气更浓郁。

2.5 水解肽相对分子质量对美拉德产物的影响

不同水解时间小麦蛋白酶解液的相对分子质量分布结果见表7，可以看出，随着水解时间的增加，水解肽相对分子质量总体表现为大相对分子质量肽逐渐减少，小相对分子质量肽逐渐增多。与0.5 h和1.5 h的酶解液相比，最佳面包风味前体物质中相对分子质量小于3 861的占比分别增加6.79%和1.59%，相对分子质量小于1 405占比分别增加12.34%和3.34%。

表6 未水解小麦蛋白与不同水解时间小麦蛋白酶解液的氨基酸组分分析Table 6Amino acid composition of unhydrolyzed and hydrolyzed wheat protein at different hydrolysis time

表7 不同水解时间小麦蛋白酶解液的相对分子质量分布Table 7The molecular weight distribution of wheat proteinhydrolysatesatdifferenthydrolysistime

1000～3000的肽尤其是小于1 000的肽具有较高的美拉德反应程度，这可能与肽链长度更短会产生更多的Amadori降解化合物有关［10］。因此，最佳面包风味前体物质比0.5 h和1.5 h的酶解产物的美拉德反应程度更高，在美拉德反应过程中产生的化合物更多、更复杂。

2.6 美拉德产物GC-MS分析结果

采用SPME-GC-MS方法对利用最佳面包风味前体物质制备得到的美拉德产物进行分析，其挥发性风味成分种类和相对含量如表8所示。从美拉德产物中共鉴定出30种风味化合物，主要成分有醛类、酮类、醇类、酯类和杂环类化合物。美拉德产物中有11种风味物质与面包表皮中的特征风味相同，包括：3-甲基丁醛、己醛、庚醛、2-戊基呋喃、正戊醇、2-甲基吡嗪、正己醇、3-辛烯-2-酮、庚醇、糠醛和苯甲醛，并且这些物质的相对质量分数在美拉德产物风味物质中占69.68%。总体来说，所制备的美拉德产物是具有面包焙烤特征风味。

表8 美拉德产物中挥发性风味成分的GC-MS鉴定结果Table 8Composition of volatile flavor compounds in maillard reaction product determined by GC-MS

序号保留时间/min种类相对质量分数/% 2-辛酮辛醛甲基戊基呋喃2，3-辛二酮-正己醇-3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯1-烯-3-辛醇庚醇糠醛--癸醛15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 12.072 12.127 12.379 12.984 13.170 13.767 14.753 14.913 15.555 15.664 15.731 16.027 16.086 16.326 16.713 18.427 18.647 19.283 21.597 25.419 27.746苯甲醛-1-壬醇十二醛2，6-二叔丁基对甲酚2，4-二叔丁基苯酚邻苯二甲酸二异丁酯1.526 0.917 0.268 0.476 0.431 2.050 1.129 0.515 1.276 0.371 0.988 1.528 2.827 2.810 2.863 3.815 0.535 0.269 0.268 3.275 0.501

3 结语

风味蛋白酶能较好地水解小麦蛋白质制备面包风味前体物质，美拉德反应时产生宜人面包焦香味的浓度与酶解产物中对面包风味形成起贡献的游离氨基酸质量分数和总氨基酸质量分数正相关，与部分水解肽的相对分子质量相关。过度水解将产生更多的糊味型美拉德反应风味物质。小麦蛋白酶解制备的最佳面包风味前体物质经过美拉德反应后具有面包焙烤特征风味。

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Enzymatic Hydrolysis of Wheat Protein for the Production of Precursors of Bread Flavor

GU Qin1，LU Ping1，HUANG Wuning2，ZHANG Yin1，WU Fengfeng1，ZHANG Yanjie3，XU Xueming*1
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214112，China；2.Yiwu Highstar Biotechnology Co.，Ltd，Yiwu 322000，China；3.Juxiangyuan Food Co.，Ltd，Zhongshan 528437，China）

Wheat protein was hydrolyzed by proteases Flavourzyme，Neutrase and Protamex with Flavourzyme being the best for the production of precursors of bread flavor and the maximum degree of hydrolysis（DH）.Based on orthogonal experiments the optimum hydrolysis parameters were: substrate concentration，5%；Flavourzyme concentration，2 000 U/g；pH，7.0；temperature，50℃；time，2.5 h.Under the condition，a DH of 35.50%was reached and Maillard reaction products as the optimum precursors of bread flavor were obtained.The hydrolysate contained 5.24 and 3.91 mg/mL more amino acids for bread flavor，7.42 and 4.45 mg/mL more total free amino acids，6.79 and 1.59% higher contents of the portion with the molecular weight（MW）below 3 861，and 12.34 and 3.34%higher contents of the portion with the MW below 1405Da than those of 0.5 h and 1.5 h，respectively. The portion with the MW below 3861Da was favorable to the Maillard reaction.SPME/GC-MS analysis proved that the Maillard reaction products formed the key bread flavor.This paper encourages the further study for the production of bread flavor compounds via the Maillard reaction.

wheat protein，flavourzyme，degree of hydrolysis，Maillard reaction products

TS213.2

A

1673—1689（2015）04—0372—07

2014-11-28

国家“十二五”科技支撑计划项目（2012BAD37B07）

*通信作者：徐学明（1968-），男，江苏苏州人，博士研究生导师，主要从事食品组分与物性研究。E-mail:xmxu@jiangnan.edu.cn