细胞肿瘤高危遗传学异常在多发性骨髓瘤危险度分层中的应用

2015-11-20罗建民郝洪岭王素云王瑞仓

中国老年学杂志 2015年14期

李燕杨涛李静杨洁罗建民郝洪岭王素云李杰袁军王瑞仓陈华

(河北省人民医院血液科，河北石家庄 050051)

多发性骨髓瘤是骨髓内浆细胞异常增生的一种血液系统恶性肿瘤，在中、老年群体中具有较高的发病率，并以50～60岁之间为多，40岁以下罕见〔1〕。患者临床大多表现出不同程度的贫血、骨痛、肾功能不全、反复感染、出血等。而各种分子遗传学异常现象会对疾病的发展产生一定的影响，并对其危险度分层和预后等产生较大的影响〔2〕。本研究利用荧光原位杂交法对初治多发性骨髓瘤及人多发性骨髓瘤细胞系的分子遗传学异常进行检测和比较，筛选细胞肿瘤高危遗传学异常。

1 资料与方法

1.1一般资料人多发性骨髓瘤细胞系7株分型与来源见表1。我院2011年12月至2014年12月83例初治多发性骨髓瘤患者设为对照组，其中男50例，女33例，年龄31～84岁，行骨髓穿刺抽取骨髓液。主要仪器和试剂包括DNA探针(北京中杉金桥生物技术有限公司)、离心涂片机(上海思伯明仪器设备有限公司)、双色双融合探针(上海信裕生物科技有限公司)、胃蛋白酶(湖北生物科技发展有限公司)、原位杂交仪(杭州奥盛仪器有限公司)。其中，双色双融合探针包括SpeetrunOrangeTM和SpeetmnGreenTM标记的IGH/CCND1和IGH/FGFR3及IGH/MAF双色双融合探针。

1.2处理标本对玻片分别进行泡酸和酒精浸泡处理，然后对人多发性骨髓瘤细胞系进行复苏，分析染色体核型，并利用PBS液进行细胞重悬。每张玻片加70 μl细胞悬液置于离心涂片机中予以5 min离心，离心结束利用甲醇、冰醋酸(3∶1)进行10 min固定后妥善保存，保存温度设置为－20℃。梯度离心细胞，获得骨髓单个核细胞后利用PBS液获得细胞悬液备用。向细胞中添加 CD138磁珠，添加量为每5×106个细胞10 μl CD138磁珠，于4℃条件下进行15 min的孵育后进行过柱分离，得到浆细胞，取3×105个浆细胞，利用1 ml PBS液予以重悬将玻片擦干之后，每张玻片加70 μl细胞悬液置于离心涂片机中予以5 min离心。离心结束进行固定并保存备用，保存温度设置为－20℃。

表1 7株人多发性骨髓瘤细胞系情况

1.3荧光原位杂交对细胞涂片进行10 min的老化，条件设置:37℃ 2×SSC，然后置于37℃ 0.2 mg/ml的胃蛋白酶中进行10 min孵育后于室温条件下，利用2×SSC进行3 min漂洗。然后分别利用75%、85%、100%的酒精脱水，每次脱水1 min。脱水完毕之后，在暗环境条件下，将1 μl去离子水和7 μl杂交缓冲液2 μl探针进行混合，并使之充分均匀。将10 μl反应体系加入每张标本中，添加完毕加盖玻片，四周封牢。置于原位杂交仪中，于78℃条件下进行5 min的热变性，并分别为42℃条件下复性16 h。将杂交后的玻璃片去掉盖玻片，立即置于72℃条件下进行0.4×SSC/0.3×NP40中进行2 min清洗。并于常温条件下进行再次清洗，晾干。然后将抗衰变剂及DAPI复染液添加到每一张片子上，并利用配有三色色滤光片的荧光显微镜计数500个细胞。

1.4统计学方法应用SPSS16.0统计软件包进行χ2检验。

2结果

2.1初治多发性骨髓瘤和骨髓瘤细胞系遗传学异常检出情况初治多发性骨髓瘤细胞遗传学总体检出率为85.54%(71/83)，伴有 RB-1缺失 39例(45.88%)、出现 P53缺失 18例(21.18%)、伴有1q21扩增46例(54.12%)、存在IGH异常54例(63.53%)、IGH/CCND1 阳性 24 例(28.24%)、IGH/FGFR3阳性 22例(25.88%)、IGH/MAF 阳性3例(3.53%)。

2.2初治多发性骨髓瘤和骨髓瘤细胞系遗传学异常比较利用不同的DNA探针进行检测，可以发现所有人多发性骨髓瘤细胞系以及大部分初治多发性骨髓瘤中均存在分子遗传学异常，但二者无统计学差异(P＞0.05)。且人多发性骨髓瘤细胞系同时合并多种遗传学异常的情况较为多见。1例为人多发性骨髓瘤细胞系伴有IGH/CCND1，且IGH/FGFR3阳性检出率显著高于初治多发性骨髓瘤(P＜0.05)。6例人多发性骨髓瘤细胞系具有1q21的扩增，但与初治多发性骨髓瘤之间无统计学意义(P＞0.05)。在RB-1缺失方面，人多发性骨髓瘤细胞系与初治多发性骨髓瘤之间的差异无统计学意义(P＞0.05)，但在P53缺失方面有统计学差异(P＜0.05)，IGH/MAF阳性有统计学差异(P＜0.05);但在1q21扩增和IGH异常、IGH/CCNDl阳性均无统计学差异(P＞0.05)。

3讨论

多发性骨髓瘤是一种血液系统恶性肿瘤，可以对人体的各脏器造成损害。随着疾病的进展，多发性骨髓瘤可出现髓外侵犯，甚至转化为浆细胞白血病。整个过程中，细胞和分子遗传学的异常事件的积累发挥了出重要的作用。在正常状态下，浆细胞会生成各种抗体，并发挥出强大的抗感染作用。但是，当浆细胞发生癌变的时候，正常的细胞功能会受到较大的影响，且出现异常的增殖现象，无法发挥正常的生理功能〔3，4〕。而这些大量增殖功能异常的浆细胞侵犯到人体各脏器，引发重要器官病变。临床对多发性骨髓瘤患者进行治疗的时候，大多采用化疗等方式。为了提高化疗效果，需要做好对疾病的准确分期，其中，细胞遗传学检查是一种常见的检查方式〔5〕。通过对患者进行细胞遗传学检查，在细胞里发现染色体异常〔6〕。多发性骨髓瘤常伴有细胞遗传学的异常，大部分人多发性骨髓瘤细胞系来源于骨髓外浆细胞肿瘤，其遗传学异常可以对各种高度侵袭性浆细胞肿瘤的遗传学特征予以较好反映〔7，8〕。多发性骨髓瘤常伴有细胞遗传学的异常，其遗传学异常分为非超二倍体和超二倍体两类，其中超二倍体被列为低危组，伴有超二倍体的患者常常预后较好，表现出更好的生存优势〔9，10〕。浆细胞肿瘤的显著特征便是基因组高度不稳定。本研究中，人多发性骨髓瘤细胞系和初治多发性骨髓瘤在IGH异常检出率不存在统计学差异;分析出现这一结果的原因，可能是因为IGH易位出现于多发性骨髓瘤的早期病变阶段，因此，对于是否存出现了IGH异常，并不会随着疾病的发展而出现相应的改变〔11〕。本次研究结果中，有1例为人多发性骨髓瘤细胞系伴有IGH/CCND1，且IGH/FGFR3阳性检出率显著高于正常多发性骨髓瘤。分析出现这一结果的原因，可能是受到本次研究所检测细胞学数量相对较少的影响，选择存在偏移。因此，还需要在扩大样本分析。1号染色体不稳定是恶性浆细胞肿瘤的重要特征，疾病的发展可能与定位于1号染色体的基因异常之间存在一定的关系〔12，13〕。13号染色体异常是多发性骨髓瘤常见的遗传学异常。p53是一种抗癌基因，因编码一种分子质量为53 kD的蛋白质而得名〔14〕。p53蛋白质能够遏制细胞的增殖，具有遏制癌细胞的作用，可以作为重要的转录因子调控150多种基因的表达。p53是机体内最重要一种抑癌因子，当p53正常发挥功能时，它参与细胞分裂的调控。而当某些原因例如基因突变使得p53蛋白功能出现异常时，则会引起失控性细胞分裂最终有可能导致癌症发生〔15〕。位于染色体17p13的抑癌基因p53的缺失会对多发性骨髓瘤的预后效果产生较大的影响，如果出现p53缺失的伴随情况，则多发性骨髓瘤常常和循环浆细胞梳理的增加相关，提示肿瘤细胞容易与骨髓微环境出现分离，产生单独存在的情况。而绝大多数大部分人多发性骨髓瘤细胞系来源于骨髓外浆细胞肿瘤，p53缺失是人多发性骨髓瘤细胞系的显著特征。

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12 李菲.多发性骨髓瘤细胞分子遗传学为基础的预后分层与治疗策略新进展〔J〕.中华医学杂志，2012;92(36):2585-7.