抑制自噬可以增加mTOR抑制剂AZD8055引起的喉癌细胞株Hep-2的凋亡

金香顺 王东旭 尤 涛 (吉化集团公司总医院，吉林 吉林 132022)

喉癌早期易于诊断，其死亡率相对较低〔1〕。资料表明吸烟和饮酒均可以增加发生喉癌的风险〔2〕。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，属于PI3K相关激酶(PIKKs)家族成员，它有两种存在形式，即 mTOR复合体(mTORC)1 和 mTORC2，其中 mTORC1 对雷帕霉素敏感〔3〕。mTOR参与蛋白质、核糖体生物合成和细胞凋亡等多项生理功能，而且研究表明 mTOR过度表达可以诱导多数肿瘤的发生〔4〕。体外实验证实mTOR抑制剂在少数肿瘤细胞类型中具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用〔5〕，但是mTOR抑制剂对喉癌细胞的作用鲜有报道。增加癌症细胞对凋亡的敏感性是癌症研究的重要的策略〔6〕。然而，某些癌症细胞对化疗药物产生抵抗一方面是由于不能启动凋亡通路，还有另一方面是细胞自噬在凋亡中发挥的保护作用〔7〕。自噬抑制剂本身表现出抗肿瘤活性，而且它还能增加其他抗肿瘤药物杀伤癌症细胞的效应〔8〕。本研究拟考察mTOR抑制剂(AZD8055)是否能引起喉癌细胞株Hep-2凋亡以及抑制自噬是否能增AZD8055的作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)，AZD8055，四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自美国Sigma公司，RPMI 1640，胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2细胞株与细胞培养 人喉癌细胞株(Hep-2)细胞购自中国科学院细胞库，培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和40 U/ml庆大霉素的RPMI1640培养基中，在5%CO2，37℃培养箱中培养，当细胞生长至对数生长期时进行实验。

1.3MTT法检测细胞活性 将Hep-2细胞以5×103/ml密度接种于96孔板(每孔加200 μl)，培养至对数生长期(24 h)，加入不同浓度药物处理24 h后，小心吸去上清，加入90 μl新鲜培养液，再加入10 μl MTT溶液，继续培养4 h，弃上清，每孔加入100 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度(A)值。细胞存活率(%)=〔A实验孔－A空白孔/(A对照孔－A空白孔)〕×100%，实验重复3次。

1.4Western检测蛋白表达 将经药物处理后的Hep-2细胞，加入细胞裂解液RIPA裂解，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)电泳。分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，Cleaved多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、Cleaved Caspase-3、细胞色素C抗体(Cell Signaling公司，1∶800)4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗3次膜，15 min/次，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(Cell Signaling公司1∶5 000)室温孵育2 h，TBST洗3次膜，15 min/次，增强化学发光法(ECL)显影。

1.5统计学方法 应用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、最小显著差数(LSD)法检验。

2结果

2.1AZD对Hep-2细胞生存率的影响 Hep-2细胞经过20、40、80 μmol/L AZD处理24 h后，细胞生存率均显著下降，并呈浓度依赖性。

2.2AZD对Hep-2细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的影响线粒体功能障碍在凋亡中起着突出的作用，线粒体功能障碍导致细胞色素C，从线粒体膜间隙释放则是多种细胞凋亡的普遍现象。PARP是细胞凋亡核心成员胱天蛋白酶(Caspase)的切割底物。Western印迹检测凋亡通路执行蛋白caspase-3及其底物PARP，结果如图1所示，经不同浓度AZD处理24 h后，与对照组相比Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP呈剂量依赖性的表达增加。另外，如图2所示细胞色素C的表达量明显增加，与空白对照相比较差异显著。以上结果表明AZD可以激活凋亡通路，诱导Hep-2细胞发生凋亡。

图1 不同浓度AZD对Hep-2细胞Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的影响

图2 不同浓度AZD对Hep-2细胞细胞色素C的影响

2.3AZD联合应用3-MA对Hep-2细胞生存率的影响5 mmol/L 3-MA作用Hep-2细胞24 h后，对细胞活性无显著影响。然而，当5 mmol/L 3-MA与20 mmol/L AZD共同作用24 h后，与单用AZD组比较，细胞活性显著降低。结果提示，3-MA和AZD联合应用具有协同作用，可更进一步降低细胞生存率。见图3。

图3 AZD联合应用3-MA对Hep-2细胞Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的影响

2.4AZD联合应用3-MA对Hep-2细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的影响 当Hep-2细胞经不同药物组处理24 h后，3-MA组与对照组相比，Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表达水平没有明显改变。而3-MA与AZD联用组与单用AZD组比较，Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表达水平明显增加。同样，3-MA组的细胞色素C表达水平与对照组相比无明显改变，而3-MA与AZD联用组与单用AZD组比较，细胞色素C表达水平显著增加。结果表明，联合应用3-MA可以明显增加AZD引起的人喉癌细胞Hep-2细胞凋亡。见图4。

图4 AZD联合应用3-MA对Hep-2细胞色素C的影响

3讨论

mTOR蛋白激酶发挥调控细胞生长，增殖，代谢和血管生成作用主要涉及PI3K/Akt信号通路〔9〕，而且普遍认为PI3K/Akt/mTOR信号通路在癌症发生发展中发挥关键作用。诸多研究显示该信号通路在多种类型的癌症异常激活，它也因此在恶性肿瘤的治疗方面成为了一个潜在的治疗靶点〔10，11〕。本研究发现mTOR抑制剂AZD8055能增加Hep-2细胞色素C释放增加，激活Caspase-3，诱导Hep-2细胞凋亡。该结果提示mTOR抑制剂具有明显的肿瘤治疗作用。细胞自噬可为肿瘤细胞提供能量，也促进肿瘤细胞死亡。激活mTOR及其上游信号分子能诱导细胞自噬的产生。ADZ8055为三磷酸腺苷(ATP)竞争性mTOR激酶抑制剂，能同时抑制mTORC1和mTORC2，Chresta等〔12〕发现联合应用细胞自噬抑制剂E64d和亮肽素，可诱导细胞凋亡，且抑制细胞增殖的效果更显著。同样发现自噬抑制剂3-MA与AZD8055联合应用对Hep-2细胞系的诱导凋亡作用更加显著。因此本研究为自噬抑制剂和mTOR抑制剂联合应用治疗喉癌提供了理论基础，同时也对寻找与研发新型靶向抗肿瘤药物提供了新的思路。

1 吴跃煌，王晓云.喉癌的流行病学及发病机制〔J〕.国外医学·卫生学分册，1999;26(3):143-6.

2 Cattaruzza MS，Maisonneuve P，Boyle P.Epidemiology of laryngeal cancer〔J〕.Eur J Cancer Oral Oncol，1996;32(5):293-305.

3 Wullschleger S，Loewith R，Hall MN.Tor signaling in growth and metabolism〔J〕.Cell，2006;124(3):471-84.

4 Liu Q，Thoreen C，Wang J，et al.Mtor mediated anti-cancer drug discovery〔J〕.Drug Disco Today Ther Strateg，2009;6(2):47-55.

5 Faivre S，Kroemer G，Raymond E.Current development of mtor inhibitors as anticancer agents〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2006;5(8):671-88.

6 Stoffel A.Targeted therapies for solid tumors〔J〕.Biodrugs，2010;24(5):303-16.

7 Roy S，Debnath J.Autophagy and tumorigenesis〔J〕.Semin Immunopathol，2010;32(4):383-96.

8 Moreau K，Luo S，Rubinsztein DC，et al.Roles for autophagy〔J〕.Curr Opin Cell Biol，2010;22(2):206-11.

9 Fasolo A，Sessa C.Targeting MTOR pathways in human malignancies〔J〕.Curr Pharm Des，2012;18(19):2766-77.

10 Grzybowska-izydorczyk O，Smolewski P.MTOR kinase inhibitors as a treatment strategy in hematological malignancies〔J〕.Future Med Chem，2012;4(4):487-504.

11 Diaz-padilla I，Duran I，Clarke BA，et al.Biologic rationale and clinical activity of MTOR inhibitors in gynecological cancer〔J〕.Cancer Trea Rev，2012;38(6):767-75.

12 Chresta CM，Davies BR，Hickson I，et al.Azd8055 is a potent，selective，and orally bioavailable Atp-competitive mammalian target of rapamycin kinase inhibitor with in vitro and in vivo antitumor activity〔J〕.Cancer Res，2010;70(1):288-98.