四逆汤对大鼠心肌纤维化模型的保护作用及其机制

陈 宇 石月萍 (辽宁医学院，辽宁 锦州 121000)

心肌纤维化是心肌重构持续发展和难于逆转的重要原因，具体表现为心肌成纤维细胞增殖，胶原合成异常，细胞外基质代谢失衡、堆积。心肌纤维化是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键，一旦心肌出现纤维化就会导致心室壁僵硬、心室舒张功能受损，使心肌电的各向异性增加，冲动传导不均一、不连续，导致心律失常，最终可能出现心力衰竭。而心肌纤维化的消退可恢复心肌细胞和心肌间质之间的平衡，改善心肌僵硬度和心功能〔1〕。因此，如何减缓和逆转纤维化对改善患者的预后，降低死亡率具有重要的意义〔2〕。

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是一类由配体激活的核转录因子，在抑制心肌纤维化过程中起着重要作用，研究表明分布于心肌组织中的PPAR激动剂通过作用于胶原代谢、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、致纤维化相关调控因子以及炎症反应等途径预防和改善心肌纤维化〔3～5〕。四逆汤作为中医名方，在抗心肌缺血、保护脑缺血后损伤、降低血压、抗动脉粥样硬化、免疫调节等方面的药理研究已取得了很大进展，但对于其抗心肌纤维化的研究较少。本研究拟观察四逆汤对大鼠心肌纤维化的抑制作用，并探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1动物 Wistar大鼠36只，雌雄各半，体重180～220 g，SPF级，适应性喂养1 w后开始实验。

1.2药品、试剂和仪器 异丙肾上腺素为济南科汇药业有限公司生产，四逆汤(由附子、炙甘草、干姜组成)按2010年《中国药典》方法制备〔6〕。细胞间黏附分子(ICAM)-1，转化生长因子(TGF)-β1酶联免疫吸附试剂盒(美国R＆D公司)，羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物技术有限公司)，AG135分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，全自动酶标仪(美国Metertech公司)，722型可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)，组织匀浆机(德国IKA公司)。

1.3方法

1.3.1心肌纤维化模型的制备 参照文献〔7〕方法制备心肌纤维化模型，大鼠背部皮下注射异丙肾上腺素5 mg·kg－1·d－1连续8 d，自由进食饮水，对照组皮下注射相同体积的生理盐水。

1.3.2动物分组及给药 将36只Wistar大鼠随机分为模型组、四逆汤组和正常对照组，每组12只。第9天开始四逆汤组大鼠给予四逆汤灌胃6.06 g/kg，1次/d，连续4 w，正常对照组和模型组灌胃相同体积的生理盐水。

1.4指标测定

1.4.1心脏重量指数 所有大鼠于末次给药后禁食禁水12 h，称取体重，然后10%水合氯醛(0.3 ml/kg)麻醉，腹主动脉取血，分离血清备用，然后开胸取出心脏，用冰生理盐水反复冲洗，再用滤纸吸干水分，电子天平称全心重量和左心室重量，心脏重量与体重的比值即为心脏重量指数，左心室重量与体重的比值即为左心室重量指数。

1.4.2胶原容积分数 取近心尖部左心室组织，常规10%中性甲醛固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋和切片，进行Masson染色，采用图像分析软件随机选取5个视野，测定心肌间质胶原容积分数(胶原面积/心肌总面积)，取其均值。

1.4.3心肌组织羟脯氨酸含量 从左心室纵取100 mg心肌组织，按照试剂盒说明书操作(碱水解法)，在550 nm波长处用分光光度法测定心肌组织羟脯氨酸含量。

1.4.4血浆ICAM-1、TGF-β1水平 大鼠肌肉麻醉后腹主动脉取血，注射器用肝素润管，2 000 r/min离心，分离血浆，采用ELISA试剂盒测量血浆ICAM-1，TGF-β1水平。

1.4.5心肌组织PPAR蛋白表达 取液氮保存的左心室心肌组织100 mg，取出后研磨成粉末状，放入EP管中，加入10倍体积的RIPA裂解液，置于冰上超声3～5次，4℃15 000 r/min离心15 min，收集上清，按BCA试剂盒操作方法测定总蛋白浓度。等量总蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入兔抗鼠PPARα、PPARγ一抗(1∶1 000)，4℃摇床孵育过夜。TBST缓冲液充分漂洗后加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育2 h，TBST清洗3次，最后于暗室进行化学发光反应，应用软件Quantity One分析目的条带光密度值。

1.5统计学分析 采用SPSS17.0软件行方差分析。

2结果

2.1各组大鼠心脏重量指数比较 模型组心脏重量指数、左心室重量指数大于正常对照组(P＜0.01);治疗后四逆汤组心脏重量指数、左心室重量指数小于模型组(P＜0.05)，见表1。

2.2各组大鼠心肌胶原容积分数 Masson染色可见正常对照组大鼠心肌细胞排列紧密、整齐，心肌间质中基本没有成纤维细胞增生;模型组大鼠心肌间质胶原沉积明显，心肌纤维化严重;四逆汤组心肌纤维细胞增生明显少于模型组，心肌间质纤维化程度明显改善，见图1。图像分析软件测定模型组大鼠心肌胶原容积分数显著高于正常对照组(P＜0.01)，与模型组比较，四逆汤组心肌胶原容积分数显著减小(P＜0.05)，见表1。

图1 各组心肌组织Masson染色

2.3各组大鼠心肌组织羟脯氨酸含量 模型组大鼠心肌组织中羟脯氨酸含量显著高于正常对照组(P＜0.01)，四逆汤组心肌组织中羟脯氨酸含量明显低于模型组(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠心脏重量指数、心肌胶原容积分数、心肌组织羟脯氨酸含量比较(s，n=12)

表1 各组大鼠心脏重量指数、心肌胶原容积分数、心肌组织羟脯氨酸含量比较(s，n=12)

与正常对照组比较:1)P＜0.01，与模型组比较:2)P＜0.05;下表同

组别 心脏重量指数(mg/g)左心室重量指数(mg/g)胶原容积分数(%)羟脯氨酸含量(μg/g)正常对照组3.32±0.15 2.30±0.11 2.79±0.43 396.2±16.7模型组 4.56±0.111)3.39±0.141)10.78±1.241)584.4±28.62)四逆汤组 3.78±0.142)2.98±0.122)6.75±0.722)508.4±15.92)

2.4各组大鼠血浆ICAM-1，TGF-β1水平 与正常对照组比较，模型组大鼠血浆ICAM-1、TGF-β1水平显著增高;四逆汤组与模型组相比，ICAM-1、TGF-β1 水平降低(P＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血浆ICAM-1，TGF-β1水平及心肌组织中PPARα、PPARγ蛋白表达量比较(s，n=12)

表2 各组大鼠血浆ICAM-1，TGF-β1水平及心肌组织中PPARα、PPARγ蛋白表达量比较(s，n=12)

组别 ICAM-1(μg/L)TGF-β1(μg/L)PPARα PPARγ正常对照组372.46±11.45 7.31±2.24 1.18±0.19 1.02±0.21模型组 545.10±24.711)15.67±6.091)0.22±0.071)0.13±0.041)四逆汤组 417.48±19.272)8.25±3.462)0.74±0.132)0.56±0.152)

2.5心肌组织PPAR蛋白表达 模型组大鼠心肌组织中PPARα、PPARγ蛋白表达量较正常对照组有所下降(P＜0.01);与模型组比较，四逆汤组心肌组织中PPARα、PPARγ蛋白表达量增高(P＜0.05)。见表2。

3讨论

心肌纤维化是多种心血管疾病的发病因素，也是决定心血管疾病预后的重要因素，其病理改变表现为心肌成纤维细胞增殖和心肌细胞外间质胶原过量积聚，多由缺血缺氧和炎症等原因导致。已有研究表明，异丙肾上腺素是β受体激动剂，可增加心肌收缩力和耗氧量〔8〕，本实验连续给予大鼠异丙肾上腺素8 d，建立大鼠心肌纤维化模型成功。

四逆汤是东汉张仲景《伤寒杂病论》回阳救逆的名方，已被中国药典收载，组方由附子、甘草、干姜3味中药组成，主要治疗少阴虚寒症〔6〕。《素问生气通天论》:“阳气者，精则养神，柔则养筋。”今心阳衰微，神失所养，则神衰欲寐;肾阳衰微，不能暖脾，升降失调，则腹部吐利。方中生附子大辛大热，温壮元阳，破散阴寒，回阳救逆，为君药。干姜，入心、脾、肺经，温中散寒，助阳通脉，为臣药。炙甘草之用有三:一则益气补中，以治虚寒之本;二则缓和干姜、附子峻烈之性;三则调和药性，使药力持久，故甘草为佐使药。本实结果表明四逆汤具有减轻心肌纤维化的作用。

近年来，大量的动物实验表明四逆汤具有清除氧自由基、减轻脂质过氧化反应、减少心肌酶释放、改善缺血心肌灌流的作用，对大鼠心脏具有积极保护作用〔9〕。目前对于其抗心肌纤维化发生、发展机制的认识还处于探索阶段。研究表明炎症反应是引起心肌纤维化的重要原因，炎性细胞因子可通过旁分泌或自分泌方式，导致心肌基质金属蛋白酶及其抑制剂比例失调，从而造成心肌细胞外基质合成增多，引起心肌纤维化、左室重构和心肌肥厚。ICAM-1是属于免疫球蛋白超家族的一种重要细胞黏附分子，正常情况下表达很少，只有受到炎症细胞因子等作用可表达于多种细胞表面，包括中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞以及心肌细胞等，主要作用为参与白细胞向炎症部位移行过程，参与免疫细胞的特异性识别，是炎症反应的可靠标志物〔10〕。研究表明ICAM-1与众多心脏病密切相关，在心肌炎、心力衰竭、慢性缺血性心肌病大鼠心肌组织中ICAM-1含量明显高于正常对照组〔11～13〕，本研究结果显示炎症因子的过度表达参与了心肌纤维化的发生发展，而四逆汤能够抑制心肌纤维化模型大鼠血浆ICAM-1水平而发挥疗效。

TGF-β1是胶原纤维和其他细胞外基质成分合成和沉积的强有力的始动因子，作为心血管系统是最重要的异构体，参与了对基质金属蛋白酶系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统以及炎症和免疫系统的调节，能增加Ⅰ型前胶原的合成增加，抑制细胞外基质的降解，使细胞外基质沉积，促进心肌纤维化〔14，15〕。游敏生等〔16〕研究发现通心络超微粉能显著抑制急性心肌梗死大鼠TGF-β1表达增加，从而保护心肌梗死后的心室重塑。本实验推测四逆汤改善心肌纤维化与抑制TGF-β1的表达有关，此结论与廖火城等〔17〕研究一致。

PPAR的激活在体内多种代谢活动中起重要的生理学作用，如调节脂肪和糖代谢，抑制肿瘤发生发展，抑制炎症反应及炎症因子生成等〔18〕，PPAR 有 3种亚型，其中 PPARα、PPARγ研究较多，Loichot等〔19〕研究显示PPARα基因敲除小鼠出现明显的心肌纤维化，导致小鼠心功能、心肌收缩能力下降。Ricote等〔20〕发现PPARγ通过抑制活化蛋白1或肿瘤坏死因子α从而调节基质金属蛋白酶的活性。赵树梅等〔21〕研究发现，PPARγ配体激活剂吡格列酮可干预并减轻糖尿病大鼠心肌纤维化程度，并可影响糖尿病早期心室重塑及改善心功能。本实验显示四逆汤能显著抑制心肌纤维化大鼠PPARα、PPARγ蛋白表达的下降，可能具有PPAR配体作用。

综上所述，四逆汤能够降低心肌纤维化大鼠心脏重量指数、减少心肌间质胶原容积分数和心肌羟脯氨酸含量，改善心肌纤维化，其机制可能与其抑制大鼠心肌组织内 PPARα、PPARγ蛋白表达下降、降低炎症因子ICAM-1水平和细胞因子TGF-β1水平有关，但有关四逆汤抗心肌纤维化的具体细胞信号调控机制还需要进一步探讨。

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