比索洛尔联合还原型谷胱甘肽改善应激性心肌病心肌重构

向仕钊 卞洲艳 周 恒 邓 伟 朱金秀 唐其柱

应激性心肌病（Takotsubo cardiomyopathy，TTC）在急性冠状动脉综合征患者中所占比例逐年增加[1]，其发病机制尚未阐明，考虑多与情感及躯体应激刺激有关[2-7]。研究发现，TTC患者交感神经活性增强，血中儿茶酚胺含量升高，慢性阻塞性肺疾病及支气管哮喘患者β2受体激动剂治疗时会诱发或加重TTC[5，8]，提示β受体在TTC发生发展过程中扮演着十分重要的角色[6]，但β受体阻滞剂在此类患者中的疗效仍存争议[1，9]。此外，应激刺激可导致机体氧化应激反应，进一步引起细胞炎性因子及凋亡信号激活[10-12]。因此，本研究拟通过复制鼠TTC模型[13]，探究选择性β1受体阻滞剂与具有抗氧化应激作用的还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）联合使用改善TTC心肌重构的疗效，以期优化临床治疗。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型构建

60只7周龄雄性C57BL/6J小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司 （编号：43004700009820），平均体重20～25 g。按照 Shao等[13]的方法构建TTC模型，即采用异丙肾上腺素50 mg/kg溶于生理盐水，按每只小鼠0.3～0.5 ml腹腔注射，1次/d，3周后超声心动示心脏因心尖部运动减弱而心底部运动亢进，呈“章鱼篓”形态提示建模成功，即可取材行后续实验。实验分组：（1）生理盐水组（Saline，0.5 ml腹腔注射，1 次/d，n=9）；（2）异丙肾上腺素组（ISO，50 mg/kg腹腔注射，1次/d，n=11）；（3）ISO+ 比索洛尔组（Biso，10 mg/kg灌胃，1 次/d，n=12）；（4）ISO+GSH 组（GSH，250 mg/kg灌胃，1 次/d，n=12）；（5）ISO+Biso+GSH 组（n=16）。

1.2 药品及试剂

富马酸比索洛尔片购自德国默克尔（批号：H20100678），还原型谷胱甘肽片购自重庆药友制药有限责任公司（批号：H20050667），异丙肾上腺素（Sigma）。 所需抗体：GAPDH（CST，USA，1：1 000）；抗-ANP抗体（1：200）、抗-BNP 抗体（1：200）、抗-CTGF抗体（1：200）、抗 CRP3 抗体（1：200）和抗TNF-α 抗体（1：200）均购自 SANTA（USA）；抗 SOD1抗体（1：500）和抗 SOD2 抗体（1：500）均购自ABCAM；抗-TGF-β1 抗体（1：200）、抗 Bax 抗体（1：500）和抗 Bcl-2 抗体（1：500）均购自 Bioworld（Canada）。

1.3 超声心动成像及血流动力学分析

3周后予小鼠行经胸M型多普勒超声成像检查（MyLab 30 CV，ESAOTE S.P.A）[4]，采集有效参数包括舒张末期左心室内径（left ventricle end-diastolic diameter，LVEDD）、收缩末期左心室内径（left ventricle end-systolic diameter，LVESD）、舒张末期室间隔厚度（left ventricular septum diastolic，IVSD）、舒张末期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall diameter，LVPWD）、短轴缩短率（fractional shortening，FS）及射血分数（ejection fraction，EF）。超声检查完毕后行血流动力学“压力-容积”（pressure-volume，P-V）分析测定，将导管传感器（SPR-839，Millar Instruments，Inc，Houston，Texas，USA）经右侧颈动脉进入左心室稳定15 min后用配备转换器（Powerlab/4SP A/D）的电导系统（ARIA）记录数据。数据采集结束后将小鼠处死并测量心重指数[心脏重量/体重（mg/g）]、肺重量/体重比（mg/mm）及心脏重量/胫骨长比（mg/mm）。

1.4 组织病理形态学检测

心脏标本用10%氯化钾溶液洗尽心腔残留血液后用10%甲醛固定，标本经石蜡包埋后以4～5μm厚度切片用于苏木素-尹红（HE）、天狼星红（PSR）及麦胚凝集素（WGA，Invitrogen）染色分析。采用400倍放大倍数镜下观察（Nikon Eclipse 80i，Japan），其中经 WGA染色的切片用免疫荧光仪（OLYPUSDP72）观察并拍照。心肌细胞横切面积计数以每个处理组计数100～200个细胞面积，衡量纤维化程度的胶原容积定量分析采用阳性胶原面积在所有胶原面积和心肌细胞面积总和中所占的比例，数据分析采用相应分析软件（Image-Pro Plus 6.0）。

1.5 Western Blot分析

心肌组织蛋白样品采用RIPA裂解液裂解心肌组织提取，所提蛋白浓度的定量分析采用BCA试剂盒（23227，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）。蛋白样品用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后蛋白样品转膜于PVDF膜，经7%的脱脂牛奶封闭后用TBST洗膜15 min，而后于杂交袋内孵上对应一抗后4℃冰箱内过夜。经含二抗的3%的脱脂牛奶封闭后于Odyssey红外成像系统（Li-Cor Biosciences）进行定量分析，目标蛋白的表达水平采用与同一张PVDF膜上的内参蛋白甘油醛-3-磷酸脱 氢 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）进行标准化对比。

1.6 实时定量RT-PCR分析

心肌肥厚及纤维化标记物的RNA表达水平检测，RNA样品提取采用TRIZol试剂盒，所提取的RNA样品量及纯度采用 SmartSpec Plus Spectrophotometer检测仪（Bio-Rad，USA）确定A260/A280和A230/A260的比值。每个样品取2 μg RNA采用低聚糖引物（表1）逆转录成cDNA，然后以含目标样品的20μL反应体系采用 SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒（TaKaRa，RR820A，Japan）进行PCR扩增，目标样品RNA表达水平采用同一内参GAPDH校正。

表1 用于实时定量RT-PCR基因表达分析的引物

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 Biso+GSH组更有效改善TTC鼠心肌肥厚程度

C57BL/6J小鼠接受腹腔注射ISO 15 min后毛发直立，自发活动明显减少。ISO+Biso+GSH组体重波动幅度最小，差异有统计学意义（F=2.48，P＜0.05）。心脏超声定量（表2）及定性（图1A）分析显示，ISO组小鼠3周后心脏功能较其他各组明显降低，分别予Biso及GSH干预后心脏功能改善，但其改善程度明显弱于二者联合使用的效果，差异有统计学意义（F=10.49，9.53，15.60，32.56，36.56，44.21，15.03，42.01 和 33.40，均为 P ＜ 0.001），可从P-V分析结果得到进一步证实（图1B）。

表2 C57BL/6J小鼠接受不同处理3周后的心脏超声改变

表2 C57BL/6J小鼠接受不同处理3周后的心脏超声改变

注：与其他各组比较，a P＜0.05；与ISO±Biso组及ISO+GSH组比较，b P＜0.05

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图1 C57BL/6J小鼠接受不同干预3周后心脏功能学改变

心脏大体、HE染色及WGA-FITC染色结果显示，仅腹腔注射ISO而无药物干预小鼠的心脏大体及心室内径大于其他各组（图2A），心肌细胞横切面积计数显示，Biso+GSH联合干预改善心肌肥厚的程度明显优于其他各组[（80.58±6.30）μm2比（70.25 ± 11.31） μm2，（141.86 ± 12.41） μm2，（102.92 ±4.83）μm2和（97.22 ±6.02）μm2，均为P＜0.05]。仅腹腔注射ISO组的心重/体重比（5.59±0.16比 4.50±0.08、5.06±0.09、5.06±0.09和4.68±0.07，均为 P ＜0.000 1）、肺重/体重比（6.19±0.07比4.34±0.13、5.67±0.10、5.79±0.14和4.99±0.11，均为P ＜0.000 1）及心重/胫骨长比（7.49±0.21比 6.42±0.16、6.92±0.05、6.72±0.08和6.31±0.07，均为 P ＜0.000 1）均明显高于其他各组，而Biso+GSH联合干预组的心重/体重比、肺重/体重比及心重/胫骨长比优于单独干预组，差异有统计学意义（F=16.51，36.57和15.50，均为P＜0.001）。为从分子水平进一步证实这种作用，后续实验对各实验组心肌肥厚指标ANP、BNP及β-MHC分别从翻译水平和转录水平进行定性、定量检测，结果和前述实验一致（图2B、C）。

图2 比索洛尔+还原型谷胱甘肽组改善心肌肥厚

2.2 Biso+GSH组改善TTC心肌纤维化程度

在TTC模型中无论给予Biso+GSH联合干预还是单独干预，胶原聚集程度都比对照组明显降低（图3A），所联合干预组效果更明显，可从胶原容积的定量分析结果得到印证（0.47% ±0.05%比0.17% ±0.01%，1.64% ±0.01%，0.67% ±0.08%和0.65% ±0.04%，P＜0.05）。为从分子水平进一步探究联合干预的效果，后续实验分别从心肌纤维化标记物的翻译水平（图3B）和转录水平（图3C）予以分析。结果发现，Biso+GSH联合干预组心肌纤维化标记物在翻译水平明显减弱，在转录水平表达量明显降低，与先前病理学结果相符合。

图3 比索洛尔+还原型谷胱甘肽组改善心肌纤维化

2.3 Biso+GSH更有效改善TTC氧化应激、炎症及细胞凋亡程度

分别从翻译水平（图4A）和转录水平（图4B）分析了TTC发病过程中的炎性因子C反应蛋白3（C-reactive protein 3，CRP3）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factorα，TNF-α），抗氧化应激的超氧化物歧化酶 1（superoxide dismutase 1，SOD1）、SOD2，抑制凋亡基因Bcl-2及促细胞凋亡基因Bax的表达情况。实验发现，Biso+GSH联合干预组CRP3、TNF-α及Bax表达量减少，转录水平下调。相反SOD1、SOD2及Bcl-2表达量却增加，转录水平上调。

3 讨论

TTC心肌重构会导致心脏结构和功能改变，因其临床特点和急性冠状动脉综合征极其相似而又缺乏统一的诊断和治疗标准[1]，极易导致对此类疾病的误诊误治。因此，科学合理用药改善其重构过程尤显重要。GSH既具有清除氧自由基发挥抗氧化应激作用，又具有调节离子分布、抑制细胞因子合成、调节凋亡相关基因平衡、促进肌联蛋白收缩及干细胞增殖、改善心室重构等作用[15-17]。Biso与GSH虽都可改善心肌重构，但有关二者联合使用改善TTC心肌重构效果的研究未见报道。本研究发现，Biso与GSH联合使用能更有效地改善TTC心肌重构，且这种效果是从抗炎症、抗氧化应激及抑制心肌细胞凋亡等多个方面发挥的。

本研究探讨了联合使用Biso和GSH改善TTC心肌重构的效果，发现3周后Biso+GSH联合干预组心功能学参数LVEDD等显著优于其他各组，心重指数HW/BW等较其他实验组低，差异有统计学意义（均为P＜0.05）。后续实验无论是在病理学水平的形态描述，还是分子水平对心肌肥厚相关标志物ANP、BNP及β-MHC的定性与定量分析，都进一步证实了联合干预组能更有效改善TTC心肌肥厚程度。心肌重构不仅仅是肥厚程度的重构，还涉及心肌纤维化程度的重构[14，18]。在对各实验组心肌纤维化程度的病理及胶原聚集程度的定量分析中发现，Biso+GSH联合干预组胶原聚集量明显减少，在翻译和转录水平对可有效反映心肌纤维化程度指标CTGF、TGF-β1及Collagen1α的定性定量分析发现，联合干预组改善心肌纤维化程度更明显。应激刺激不仅会导致参与TTC起病过程且具有较大不良反应的儿茶酚胺大量产生[19]，而且会引起机体氧化应激反应。氧化应激反应过程中产生的过多氧自由基不仅可引起细胞炎性因子及凋亡信号的激活[10-12]，还可对作为心肌组织主要能量来源的线粒体产生毒性作用导致其功能障碍，心脏能量供应不足，进而加剧TTC患者病程恶性进展[20-21]。基于此，本研究还从抗氧化应激、炎症及细胞凋亡程度的角度探讨了在改善TTC心肌重构中联合使用Biso和GSH的效果。实验发现，Biso+GSH联合干预组中作为炎症反应的主要参与者TNF-α和CRP3表达均下调，抗氧化应激的关键酶SOD1与SOD2表达均上调，抑制凋亡过程的基因Bcl-2表达上调，而促凋亡基因Bax表达却下调。

图4 比索洛尔+还原型谷胱甘肽组抗氧化应激、炎症及细胞凋亡作用

总之，本研究发现Biso+GSH能更好地改善TTC心肌重构，而且这种作用是通过多层面发挥的，其具体机制有待今后进一步研究。在临床工作中无论是对TTC还是其他疾病的治疗均应全方位、多层次考虑，以最大程度地优化临床治疗方案。研究中尚存不足如尚未深入到对其具体作用的分子机制及其靶位的研究、这种联合使用效果会对小鼠心脏电生理产生什么样的影响、样本量过少等，有待今后进一步完善。