STAT3和P16在人脑神经胶质瘤中的表达及临床意义

邵冰水 毛冲冲 翟广 刘献志

(郑州大学第一附属医院 神经外科 河南 郑州 450052)

神经胶质瘤是中枢神经系统中最为常见的恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的40% ～50%［1］。近年来，虽然神经外科的技术水平、放疗设备和化疗药物等方面都有了长足发展，但由于神经胶质瘤具有侵袭性生长，与正常的脑组织相粘连、分解不清，对放、化疗高度抵抗等特点，治疗效果并不理想。信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)属于胞浆蛋白家族，具有信号转导、转录调控双重功能［2］。P16 又叫做MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是一种抑癌基因，它可以调控细胞周期，负调节细胞的增殖及分裂。本实验的目的是研究人脑神经胶质瘤中STAT3 和P16 表达情况，进行差异性及相关性统计分析，进而探讨二者在人脑神经胶质瘤中的表达和相互关系，为临床的诊断和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2012年10月至2013年11月期间郑州大学第一附属医院75 例胶质瘤患者术中切除的胶质瘤组织和临床资料，根据病理检测结果，其中男性患者42 例，女性患者33 例，年龄在14 ～72 岁之间，平均年龄为(43.28 ±13.65)岁。其中年龄＜43 岁患者45 例，年龄≥55 岁患者29 例。肿瘤直径≤3 cm的患者13 例，直径3 ～5 cm 的患者28 例，直径＞5 cm的患者33 例。按照WHO(2000年)胶质瘤病理分级标准，可分为Ⅰ级17 例，Ⅱ级20 例，Ⅲ级18 例，Ⅳ级20 例。将Ⅰ级、Ⅱ级归为低级别组，Ⅲ级、Ⅳ级归为高级别组。另外收集10 例该科室同时期因重度颅脑外伤行内减压手术切除的脑组织作为正常脑组织(切片均经病理科医师审定)。选取标准:所有患者无其他严重合并症，均为首次行手术治疗，术前均未行放疗、化疗等治疗。相关影像学检查均于手术前完善。所有标本在手术切除之后30 min 内放入液氮罐中，然后置于－80℃Thermol 低温冰箱中进行保存。所取标本均通过本院伦理学委员会及患者家属同意。

1.2 主要仪器与实验试剂

1.2.1 主要仪器 图像采集采用显微数码照像系统(德国Lecia);图片分析系统及其他仪器由本院病理科提供。

1.2.2 实验试剂 兔抗人STAT3 多克隆抗体及鼠抗人P16 单克隆抗体均购于武汉博士德公司;S－P9000试剂盒、DAB 显示增强剂、PBS、苏木素染液等均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法 先用4%甲醛将组织标本固定1 h，石蜡包埋;用多聚赖氨酸对载玻片进行预防脱片处理;切片(厚约3 μm);采用S－P 免疫组化法对75 例人脑神经胶质瘤及10 例正常脑组织进行STAT3 及P16 蛋白的特异性检测，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。流程如下:切片脱蜡、冲洗、烤片;冷却后用蒸馏水、PBS 缓冲液反复冲洗;H2O250 μl 滴加在切片标本上，室温下孵育15 min，再次冲洗;滴加1∶100 稀释的一抗，阴性对照组用PBS 缓冲液代替一抗，将切片和保湿盒一同放入4℃恒温箱过夜(约16 ～18 h);PBS缓冲液冲洗、复温，再次冲洗;DAB 显色;苏木素复染;常规乙醇梯度脱水;封片(中性树胶)，观察。

1.4 结果分析 双人双盲法观察切片，将阳性着色细胞所占视野内细胞的百分比与细胞着色强度相结合计算(二级计分法)。具体标准如下:未着色为0 分，弱染色为1 分，中等染色为2 分，强染色为3 分。然后按着色阳性细胞占同类细胞数的百分比给予计分:1 分(0% ～5%)，2 分(6% ～25%)，3 分(26% ～50%)和4 分(＞50%)。最终的结果为阳性细胞的百分率计分和染色强度计分的乘积产生的加权分数，即:0 分为阴性(－)，1 ～4 分为弱阳性(+ )，5 ～8 分为阳性(+ +)，9 ～12 分为强阳性(+ + +)。

1.5 统计学处理 所有实验数据均采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。阳性表达情况的比较采用χ2检验与Spearman 秩相关法进行相关性分析，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STAT3 在正常脑组织和人脑神经胶质瘤中的表达 STAT3 蛋白表达的阳性信号主要位于胞浆中，少量位于胞核。在10 例正常脑组织标本中，STAT3 表达全阴性。在低级别人脑神经胶质瘤中，STAT3 的阳性表达率为37.84%(14/37)，高级别组为71.05%(27/38);STAT3 在低级别组人脑神经胶质瘤中的表达水平明显低于高级别组，差异具有统计学意义(P=0.008)。按照秩相关法对表达水平和病理级别进行分析，得出相关系数r=0.457，P=0.000。见图1、2、3。

图1 STAT3 在正常脑组织中的表达(SP×400)

图2 STAT3 在低级别胶质瘤中的表达(SP×400)

图3 STAT3 在高级别胶质瘤中的表达(SP×400)

2.2 P16 在正常脑组织和人脑神经胶质瘤中的表达P16 蛋白表达的阳性信号主要位于胞浆中，少量位于胞核中。在10 例正常脑组织中标本中，P16 表达全阳性。在低级别人脑神经胶质瘤中，P16 的阳性表达率为78.4%(29/37)，高级别组为28.95%(11/38);P16 在低级别组人脑神经胶质瘤中的表达水平明显高于高级别组，差异具有统计学意义(P=0.029)。按照秩相关法对表达水平和病理级别进行分析，得出相关系数r =0.457，P=0.003。见图4、5、6。

图4 P16 在正常脑组织中的表达(SP×400)

图5 P16 在低级别胶质瘤中的表达(SP×400)

图6 P16 在高级别胶质瘤中的表达(SP×400)

2.3 STAT3 与P16 在人脑神经胶质瘤中表达的相关性 根据Spearman 等级相关性分析，STAT3 蛋白和P16 蛋白之间存在相关性，进一步分析可得:r=－1.000，P ＜0.05，STAT3 与P16 在人脑神经胶质瘤中的表达存在负相关。见表1。

表1 ARHI 蛋白与突变型P53 蛋白等级相关图表

3 讨论

信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)属于一类转录因子，是由酪氨酸蛋白激酶活化，介导细胞反应性和增生性信号的细胞质转录因子家族［3］。具有信号转导与转录调控双重功能。至今在哺乳动物体内细胞发现的STATs 主要成员有7 个，1994年作为白细胞介素－6信号转导中的急性期反应因子，STAT3 被提取纯化出来［4－5］。有研究表明，STAT3 可以通过JAK/STAT 途径，掌控下游多种基因的转录激活［6］，在调节细胞生长、分化以及凋亡等过程中发挥着重要影响。研究发现，与正常脑组织中的胶质细胞相比，STAT3 在恶性胶质瘤细胞中存在异常的活化，提示人脑胶质瘤的发生与STAT3 蛋白的异常活化可能存在一定的相关性。另外，有研究显示［7］，STAT3 的活化在神经干细胞的分化中发挥着重要作用，神经干细胞中抑制STAT3 蛋白的表达可以使干细胞向神经元的方向分化。从实验结果可以看出，STAT3 在高级别的人脑神经胶质瘤中的表达水平明显要高于低级别胶质瘤(P ＜0.05)，由此可以得出结论，随着人脑神经胶质瘤恶性程度的增加，STAT3 蛋白的表达水平也逐渐增高。

P16 基因，又叫做多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，MTS1)，定位于人类9 号染色体9p21，对细胞的生长起着负性调节作用。由Kamb 等［8］在1994年首次报导在人脑胶质瘤细胞株当中存在P16 基因的丢失，随后Carydis 等［9］又证实了P16 基因以及其表达的丢失常见于恶性程度比较高的原发性人脑神经胶质瘤中。从实验结果可以看出，P16 在低级别组人脑神经胶质瘤中的表达水平明显高于高级别组人脑神经胶质瘤(P ＜0.05)，由此得出结论:随着人脑神经胶质瘤病理级别以及恶性程度的增高，P16 的表达逐渐减弱。

根据实验结果，STAT3 在人脑神经胶质瘤中的表达随着病理级别的升高逐渐增强，P16 在人脑神经胶质瘤中随着病理级别的升高，表达逐渐减弱。二者呈负相关性。通过大量查阅文献发现，STAT3 对VEGF的表达具有调控作用，通过阻断STAT3 信号转导通路能导致VEGF 表达的下调，从而使恶性肿瘤血管形成的能力降低。

综上所述，随着STAT3 和P16 及其相关性研究的逐渐深入，二者可能成为判断人脑胶质瘤恶性程度及预后的有效指标，然而当前STAT3 和P16 的协调作用和互相制约的相关机制及如何联合靶点治疗的机制尚待解决，但为联合检测、评估人脑胶质瘤的诊疗提供了新的途径和思路。

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