PI3K信号通路在LPS诱导RAW264.7细胞表达sTREM-1中的作用

冯清州 杜 娟 高伟良 刘 晅

1.深圳市第七人民医院ICU，广东深圳518081；2.暨南大学第二临床医学院呼吸内科，广东深圳518081

PI3K信号通路在LPS诱导RAW264.7细胞表达sTREM-1中的作用

冯清州1杜 娟1高伟良2刘 晅1

1.深圳市第七人民医院ICU，广东深圳518081；2.暨南大学第二临床医学院呼吸内科，广东深圳518081

目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路在脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞表达可溶性髓样细胞触发受体-1（sTREM-1）中的作用。方法培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7，采用相同浓度的LPS在不同时间诱导RAW264.7细胞，应用Western blot法分别检测PI3K蛋白表达水平，RT-PCR法检测PI3K mRNA表达水平，酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞培养血清中sTREM-1表达水平。用不同浓度PI3K特异性抑制剂LY294002处理细胞，观察上述指标变化。结果LPS可时间依赖性地诱导RAW264.7细胞PI3K蛋白、PI3K mRNA的表达；LY294002可浓度依赖性地抑制PI3K蛋白、PI3K mRNA的表达；LY294002阻断PI3K信号转导通路后，LPS对sTREM-1表达的诱导作用受到显著抑制，并且具有剂量依赖性。结论LPS通过PI3K信号通路诱导RAW264.7细胞表达sTREM-1。

磷脂酰肌醇3-激酶；脂多糖；可溶性髓样细胞触发受体-1

可溶性髓样细胞触发受体-1（soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1，sTREM-1）可与下游细胞因子形成一个正反馈的自分泌调节回路，促使炎性反应增强、放大，影响脓毒症的发生发展［1-2］。sTREM-1是脓毒症发病中的早期关键炎症介质，但其被诱导表达的信号转导机制尚不十分清楚。研究表明，磷酯酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）在信号通路被激活时可作为第二信使结合并激活多种细胞内靶蛋白，组成一个信号级联系统，在炎症的发生及发展过程中发挥关键的调控作用，PI3K信号通路为有效干预炎症相关疾病进程的关键靶点［3-4］。在脓毒症发病的过程中，PI3K信号转导通路可能影响sTREM-1的表达，本研究对此作出探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞（美国ATCC细胞库）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；DMEM培养基（Gibcol BRL公司）；P13K特异性抑制剂LY294002（Promega公司）；PI3K的基因引物（上海生工生物科技有限公司）；RTPCR试剂盒（日本TaKaRa公司）；兔抗鼠PI3K单克隆抗体、羊抗兔IgG单克隆抗体（Santa Cruz公司）；小鼠sTREM-1 ELISA试剂盒（深圳晶美公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组在37℃、5％CO2恒温培养箱中，常规培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7，培养基选用DMEM培养液，每48小时更换1次。细胞铺满瓶底时传代，调整细胞密度为1×106个/ml，接种于6孔板，无血清培养基培养，72 h后随机分组培养：①LPS组：加入终浓度为100 mg/ml的LPS培养，在加入LPS后1、6、12、24、48 h等不同时间点收集细胞；②LY294002+LPS组：加入不同终浓度为5、10、20 μmol/L的LY294002液预处理细胞1 h后，加入100 mg/ml LPS刺激1 h后收集细胞。

1.2.2 PI3K蛋白表达检测采用Western blot法检测PI3K蛋白表达，收集细胞，经PBS洗涤2次，加入裂解液充分裂解，裂解产物12 000 r/min离心20 min，收集上清。使用二辛可酸法（bicinchoninic acid，BCA）测定总蛋白量。每份样品取50 μg蛋白，加入SDS-Loading Buffer混匀，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直凝胶电泳300 mA电转移至聚偏二氟乙烯膜。5％脱脂奶粉室温封2 h，TBS洗膜后分别加PI3K抗体4℃孵育过夜，1∶2500辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG单克隆抗体作为二抗孵育PVDF膜，室温孵育2 h，免疫印迹化学发光（ECL）试剂曝光。用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与抗β-actin抗体孵育。Quantity One软件分析蛋白条带。目的蛋白定量采用灰度比值PI3K/β-actin计算。PI3K相对表达量=PI3K Ct值倒数/GADPH Ct值倒数。

1.2.3 PI3K mRNA检测采用RT-PCR法检测PI3K mRNA的表达，PI3K的基因引物序列由Primer 5.0软件自行设计，上游序列：5′-CC AAG AGC GGT ACA GCA AAG AAT-3′，下游序列：5′-TC GCC GTC CAC CAC TAC AGA-3′，扩增产物长度500 bp。内参β-actin的上游引物序列为：5′-GC CTC GCT GTC CAC CTT CCA-3′，下游引物序列为：5′-CA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3′，扩增产物长度为259 bp。收集细胞后用Trizol试剂提取细胞总RNA；按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，再利用引物对目的基因进行扩增，扩增后产物于1.5％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在凝胶成像系统中进行分析，对各条带的积分光密度进行测定，然后同内参β-actin的光密度积分值进行对比，得出PI3K mRNA表达的相对水平。

1.2.4 sTREM-1表达的影响用ELISA法检测细胞培养上清液中sTREM-1含量，具体操作遵照说明书进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件分析处理，计量资料数据采用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS对PI3K蛋白表达的影响

100 mg/ml LPS作用1、6、12、24 h后，PI3K蛋白表达不断增高，24～48 h PI3K蛋白表达降低（图1）。

图1 LPS对PI3K蛋白表达的影响

2.2 LPS对PI3K mRNA表达的影响

100 mg/ml LPS作用1、6、12、24 h后，PI3K mRNA表达不断增高，24～48 h PI3K mRNA表达降低（图2）。

图2 LPS对PI3K mRNA表达的影响

2.3 LY294002对PI3K mRNA表达的影响

LY294002可抑制PI3KmRNA表达，随着LY294002浓度的增高，抑制作用更加明显，呈浓度依赖性（图3）。

图3 LY294002对PI3K mRNA表达的影响

2.4 LPS对sTREM-1表达水平的影响

随着LPS（100 mg/ml）作用时间的延长，sTREM-1表达水平呈时间依赖性上升（图4）。

图4 LPS对sTREM-1表达水平的影响

2.5 LY294002对sTREM-1表达的影响

LY294002可抑制sTREM-1表达，随着LY294002浓度的增高，抑制作用更加明显，呈浓度依赖性（图5）。

图5 LY294002对sTREM-1表达的影响与0 μmol/L比较，*P＜0.05，**P＜0.01

3 讨论

脓毒症的发病机制非常复杂。研究表明，感染致使机体炎症细胞活化并产生多种促炎因子［5-6］，这些因子又可引起更多炎症细胞的激活，两者互为因果，形成炎症级联反应，并且这种级联反应逐级放大，最终导致脓毒症的发生和发展。因此，适时合理地干预炎性反应的始动环节，是治疗脓毒症的重要目标。

sTREM-1可选择性地表达在中性粒细胞和成熟单核、巨噬细胞上，能诱导这些细胞分泌TNF-α、IL-1β、干扰素γ等促炎细胞因子［6-7］；sTREM-1还可进一步作用于炎性反应，促进炎症因子的释放，还可正反馈促进TREM-1表达的上调，从而引起炎性反应的增强、放大，导致过度的炎性反应［8-9］，因此，sTREM-1作为一种重要的促炎症细胞因子，是导致脓毒症发生发展的关键启动因子，但是关于脓毒症时调控TREM-1表达的机制尚未完全阐明。

PI3K家族是一类同时具有脂质与蛋白激酶活性的，可特异性催化磷脂酰肌醇及其衍生物肌醇环3-位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶，PI3K是许多细胞活动、分子信号转导的关键通路［10-12］，多种刺激均可导致PI3K活化，通过影响基因的转录和调控，调节细胞的生物学行为。

近年研究发现，PI3K信号通路在炎症的发生及发展过程中发挥关键调控作用［4，13-14］。在卵清蛋白诱发的小鼠支气管哮喘模型中，PI3K能够减少嗜酸粒细胞的数目，缓解嗜酸粒细胞增多症；而PI3K-/-小鼠经卵清蛋白诱发处理后，其导致的嗜酸性气道炎症与气道重构较对照组显著降低，支气管肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞数目大幅度减少。PI3K亦对肥大细胞功能具有调节作用，实验研究发现，应用LY294002及渥曼青霉素等PI3K抑制剂，可减少肥大细胞的脱颗粒［15］。

PI3K信号通路的激活与脓毒症的发病亦密切相关。Yum等［16］研究发现，在注射内毒素诱发的脓毒症模型中，阻断PI3K可显著减少急性肺损伤与水肿的发生，降低炎症介质浓度与中性粒细胞募集。Martin等［17］利用了盲肠结扎与穿孔模型，采用多种方式抑制PI3K，结果显示其均可保护模型小鼠免受盲肠结扎与穿孔导致的死亡、肝肺损伤、心血管损伤与凝血功能障碍。而在急性或慢性胰腺炎模型中，PI3K抑制剂可增加实验组动物存活率，降低疾病严重程度，减少组织损伤。因此，阻断PI3K信号传导通路可减轻炎症，达到治疗目的。

有学者发现PI3K和p38MAPK信号通路通过调控Ca2+从而参与TREM-1信号传导，PI3K通路的活化可增强sTREM-1的表达，而抑制PI3K活化可抑制sTREM-1的表达［18-20］。而本研究亦发现，LPS诱导RAW264.7细胞后PI3K mRNA表达增高，且呈时间依赖性，同时观察到sTREM-1表达增高，表明PI3K信号通路可能介导sTREM-1的表达。为明确PI3K信号通路在脓毒症中对sTREM-1的介导作用，本研究采用PI3K特异性抑制剂LY294002抑制PI3K的活化，结果显示在抑制PI3K mRNA表达的同时，对sTREM-1的表达具有拮抗作用，并且具有剂量依赖性。可见，PI3K信号通路在LPS诱导RAW264.7细胞表达sTREM-1中可能起到关键作用，PI3K抑制剂可能有助于减轻脓毒症炎性反应，这为治疗脓毒症提供了一个新的思路。

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Role of the PI3K signaling pathway in sTREM-1 expression of RAW264.7 cells by LPS

FENG Qing-zhou1DU Juan1GAO Wei-liang2LIU Xuan1
1.Department of ICU，the Seventh People's Hospital of Shenzhen，Guangdong Province，Shenzhen518081，China；2.Department of Respiratory Medicine，the Second Clinical Medicial College of Ji′nan University，Guangdong Province，Shenzhen518081，China

Objective To investigate the role of the PI3K signaling pathway in sTREM-1 expression of RAW264.7 cells by LPS.Methods RAW264.7 cells of macrophage cell line were cultured，RAW264.7 cells were induced with the same concentration of LPS by different time，PI3K protein expression level was detected by Western blot，PI3K mRNA expression level was detected by the RT-PCR，the expression level of sTREM-1 was detected by enzyme linked immunosorbent assay method.The RAW264.7 cells were treated with LY294002 by different concentration，the changes of above indexes were observed.Results LPS could induce the PI3K and PI3K mRNA expression of RAW264.7 cells by dependent time.LY294002 could inhibit the PI3K and PI3K mRNA by dependent concentration.After PI3K signal transduction pathway was blocked by LY294002，the sTREM-1 expression was significantly inhibited by dose dependent.Conclusion The PI3K signaling pathway is induced in sTREM-1 expression of RAW264.7 cells by LPS.

Phosphoinositide 3-kinase；Lipopolysaccharide；Soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1

Q245

A

1674-4721（2015）05（b）-0011-04

2015-01-07本文编辑：卫轲）

广东省深圳市盐田区科技计划项目（201202 177）